Fisiología celular y molecular del sistema auditivo I. Estructura y función del oído en los mamíferos. II. El órgano de Corti. III. Mecanotransducción IV. Fluidos Cocleares. El potencial Endococlear. Reciclado del K+. V. Membrana Basilar. Tonotopía. VI. Inervación aferente . Sinapsis en cinta VII. Desarrollo Inervación. Inervación eferente transitoria VIII. El amplificador coclear. El sistema MOC Eleonora Katz FSN 2016 El oído humano Oído externo medio Oído interno htpp://www.iurc.montp.inserm.fr/cric.audition (promenade around the cochlea) Vias auditivas ascendentes primarias Via sensorial reticular Corteza primaria; memoria, reconocimiento e integración de la señal Cuerpo geniculado medial: integración, pasaje de la información de frecuencia, intensidad y binauralidad a la corteza, respuesta vocal Colículo inferior: Integración, localización binaural, detección del timbre , reflejo de alerta y vestíbuloocular 1-sulcus lateral 2-área temporal 3-corteza auditiva Oliva superior : LSO, MSO, MNTB: Núcleo coclear: decodifican localización del se sonido en el espacio aspectos básicos de la señal como duración, intensidad y frecuencia Ganglio espiral: en la cóclea (cuerpos de las neuronas aferentes que inervan las IHCs y las OHcs) La percepcion consciente requiere la integridad de ambos sistemas. Durante el sueño la via auditiva primaria funciona normalmente,pero no hay percepcion consciente posible porque la conexión entre las vias reticulares y los centros de motivacion y alerta estan inactivos. Hay dos parámetros del sonido relevantes para la audición Sonido = banda audible del espectro mecánico Frecuencia (ciclos/seg = Hz) Amplitud (presión = decibeles) diferenciación del tono diferenciación de la intensidad Se utiliza una escala comparativa y logarítmica 1) I1/I2 el log I1/I2 = bel (como es muy grande se utiliza el bel/10) Decibel (dB) I1 = 1015 e I2 = 1 10 log (1015/1) = (Log 1015 = 15; Log 1 = 0) = = 10 x 15. Rango dinámico de la audición es de 150 dB Si se toman presiones: dB = 20 log p1/p2 Como el decibel es una unidad relativa, para las aplicaciones acústicas se asigna el valor de 0 dB al umbral de audición del ser humano: p2 = 20 µPA (umbral de detección de un sinusoide de 1000-4000 Hz para un adulto joven) (SPL) Tono puro: onda regular intensidad, período y tiempo Tonos complejos: la onda está compuesta por una frecuencia característica (tono) más los armónicos (timbre). Subir el tono en una octava significa aumentar 2x la frecuencia fundamental Ruido: no tiene una frecuencia característica Curva audiométrica para un sujeto con audición normal Oído externo El oído externo funciona como una antena acústica: la aurícula junto con la cabeza, difractan y focalizan las ondas sonoras, el canal auditivo funciona como un resonador (al oscilar selecciona ondas de frecuencias preferenciales) martillo yunque estribo Oído medio ADAPTADOR ENTRE EL AIRE Y EL MEDIO LÍQUIDO DEL OIDO INTERNO SIN SU FUNCIÓN EL 98% DE LAS ONDAS SE REFLEJARIAN - (1) Malleus ; - (2) Malleus ligament ; - (3) Incus ; - (4) Incus ligament; - (5) Stapes muscle (stapedius); - (6) Stapes footplate; - (7) Eardrum; - (8) Eustachian tube; - (9) Malleus muscle (tensor tympani); - (10) Nerve (chorda tympani) sectioned. 1. Anterior semicircular canal 2. Ampulla (superior canal) 3. Ampulla (lateral canal) 4. Sacculus 5. Cochlear duct 6. Helicotrema 7. Lateral (horizontal) canal 8. Posterior canal 9. Ampulla (posterior canal) 10. Oval window 11. Round window 12. Vestibular duct (scala vestibuli) 13. Tympanic duct (scala tympani) 14. Utricule Oído interno 0.5 mm 2 mm La cóclea Transformar el estímulo acústico en una señal eléctrica y resolver ese estímulo en sus frecuencias componentes. 1-Inner hair cell 2-Outer hair cells 3-Tunnel of Corti 4-Basilar membrane 5-Reticular lamina 6-Tectorial membrane 7-Deiters' cells 8-Space of Nuel 9-Hensen's cells 10-Inner spiral sulcus Epitelio sensorial del oído interno: El órgano de Corti. 2020µM µM Células ciliadas internas (CCI) 3.500 1. Nucleus 2. Stereocilia 3. Cuticular plate 4. Radial afferent ending (dendrite of type I neuron) 5. Lateral efferent ending 6. Medial efferent ending 7. Spiral afferent ending (dendrite of type II neuron) Células ciliadas externas (CCE) 12.000 Mecanotransducción en el órgano de Corti Estímulos sonoros Células ciliadas OHC IHC Mecanotransducción ● CCE: 30-100 estereocilias ● 1-6 µm de largo Células ciliadas externas Órgano de corti >Altura < Altura Componentes moleculares de los estereocilios Los tip-links son fundamentales para la mecanotransducción Assad et al., 1991 Adaptación Dos formas de adaptación: 1- Rápida: 1-2 ms (Ca2+) 2- Lenta: 10-100s ms (Ca2+ y Miosina-1c) Beurg et al., 2006 Identidad del canal mecanotransductor? ES UN CANAL CATIONICO INESPECÍFICO PERO AUN NO HA SIDO CLONADO Science Dic. 2004 Fin de la Primera clase Auditory Transduction (2002) [www.keepvid.com].mp4 Compartimentos y fluidos cocleares La stria vascularis y el potencial endococlear Secreción activa de K+ Na+-K+ATPasa Co-transportador de Na+-Cl--K+ Canales de K+ Conexinas 1-membrana de Reissner 2-ducto coclear 1- mb de Reissner 3-stria vascularis 2- c.marginales 3- c.basales 4- capilares sanguíneos Recirculación del K+ Mammano & Ashmore 2008 Potenciales receptores en las células ciliadas Transducción del estímulo sonoro y actividad en las dendritas de las neuronas que forman el nervio auditivo Potencial receptor en las CCIs Como cambian los potenciales receptores en la CCIs al aumentar la amplitud del estímulo sonoro Guinea-pig, intracel. recordings Russell & Sellick, 1983 Como cambian los potenciales receptores en la CCIs al aumentar la frecuencia del estímulo sonoro DC component AC component Palmer and Russell, 1986 En la cóclea se discriminan las frecuencias componentes del sonido Tonotopía Kandler et al., 2009 Enganche de fase Independientemente de la amplitud del estímulo, las neuronas que forman el nervio auditivo siempre disparan en la misma fase de la onda Count Sound wave Auditory Nerve 1 ms 0 Fig10: 1kHz stim, spont rate 46/s 0.5 Time (ms) 1.0 Rose et al., 1967 Sintonización de las fibras del nervio auditivo Kiang et al., 1965 Ruggero, 1992 Patrones de expresión diferenciales de numerosas proteínas y diferencias en la morfología entre la base y el apex de la cóclea Mamíferos: órgano de Corti Review: Zoe F. Mann, Matthew W. Kelley 2011 En los mamíferos, la longitud de las OHCs varía a lo largo de la cóclea en forma consistente con las propiedades de la membrana basilar cada región El acople mecánico entre las OHCs y las células de soporte también varía desde la base al apex de la cóclea Cochlear animation [www.keepvid.com].mp4 Innervación del órgano de Corti 1. IHCs have 95% of afferent glutaminergic synapses (blue). 2. IHC afferents are contacted by lateral efferent synapses that originate in the brainstem (pink). 3. OHCs have 5 % of afferent synapses; their function is unknown (green). 4. OHCs have efferent cholinergic (ACh-activated synapses (red). Stephan Blatrix Inervación Aferente Fuchs, Glowatzki and Moser, 2003 Rutherford 2015 Proteínas involucradas en liberación vesicular en sinápsis del SNC Proteínas involucradas en liberación vesicular en la sinápsis en cinta Synaptophysin Synapsin Synaptotagmin I Synaptotagmin II Safieddine & Wenthold, 1999 Otoferlina: candidato a sensor de Ca2+ para la exocitosis en las CCI ABR : P30 mice at 20–100 dB SPL of broadband clicks. Roux et al., 2006 Otras proteínas asociadas a la “ribbon” Nouvian et al., 2006 Nouvian et al., 2011 Transmitter release at the hair cell ribbon synapse. Elisabeth Glowatzki and Paul A. Fuchs 2002 La liberación es multivesicular y mediada por receptores de glutamato de tipo AMPA Doble patch para estudiar exocitosis en la sinapsis aferente de las CCI Goutman & Glowatzki, 2007 La adaptación que se observa en el nervio auditivo se debe a adaptación en la transmisión sináptica Respuestas del nervio auditivo Adaptación Función Tasa disparo-Intensidad Taberner &Liberman 2005 Fibras aferentes de tipo II Se requiere la activación de 6 OHCs para producir un potencial de acción en la fibra aferente de tipo II Weisz et al., 2009; 2014 Algunos factores importantes en la transmisión sináptica en las CCI: 1) Canales de Ca2+ tipo L, de baja inactivación, bajo umbral 2) Sensor de Ca2+, otoferlina candidato 3) Dependencia lineal de la liberación del NT con el Ca2+ 4) Ribbon 5) Localización de vesículas, su disponibilidad 6) Liberación multivesicular, mecanismo desconocido, no necesariamente igual en todas las sinapsis en cinta 7) Receptores postsinápticos de glutamato, GluR2/3, 4, NMDA? Inervación eferente La transducción sonora es modulada por una inervación eferente olivococlear que va desde el SNC hacia la cóclea. MOC Warr & Guinan 1979 LOC Desde el nacimiento hasta P12 (comienzo de la audición en ratas y ratones), las IHC son también inervadas por el sistema MOC. El sistema MOC es inhibitorio Sinapsis transitoria MOC-IHC La estimulación de las fibras Antes del comienzo de la eferentes MOC reduce la audición las IHCs disparan frecuencia de2+PAs. Se postula que PAs de Ca espontáneos estaría regulando la actividad y el que promueven la liberación correcto establecimiento de la vía de glutamato en la primer auditiva durante el desarrollo. sinapsis del sistema auditivo Stimulation of MOC fibers Beutner y Moser 2001 Goutman et al., 2005 Glowatzki & Fuchs 2000 En P9-11 Vm = -40 mV La sinapsis MOC-IHC es funcional desde P0 hasta P13-14 Glowatzki & Fuchs, Science 2000; Elgoyhen et al., PNAS 2001; Katz et al., J. Neurosci 2004; GomezCasatti et al., J. Physiol 2005; Goutman et al., J. Physiol 2005; Zorrilla de San Martín et al., J. Neurosci, 2010; Roux et al., J. Neurosci 2011; Katz, Elgoyhen & Fuchs, 2011; Wedemeyer et al., J. Neurosci, 2013; Fuchs , 2014; Katz & Elgoyhen, Frontiers in Neurosci 2014; Electromotilidad (Brownell, 1985) Vibración de la membrana basilar al ser estimulada por un tono puro de 10 Hz Amplificación o aumento de la ganancia del sistema y sintonización fina No es bloqueada por venenos metabólicos No requiere ATP No es un mecanismo basado en movimientos de actina ni de microtúbulos Q10 1.3-1.5 (difusión) Depende el Vm y no de la corriente (remplazan iones y ven que la I cambia pero sigue habiendo cambio de longitud que se mantiene en tanto se mantenga ese Vm). La amplificación y la sintonización son dependientes de la amplitud del estímulo y de la frecuencia, siendo máximas para la CF. CF = 18 kHz Ganancia: desplazamiento de BM/desplazamiento del estribo Electromotilidad y Estructura de las CCEs Microscopía de Transmisión Electrónica 100 nM Microscopía de Fuerza Atómica Trama subcortical Actina Espectrina Cisternas de RE Se postuló que tendría que existir una proteína motora sensible al voltaje 2000 Cambios de longitud de la CCE en función del voltaje Se cuantifican los cambios de longitud de la célula en función de los cambios de voltaje He et al., 1997 La electromotilidad se puede medir también como cambios en la capacitancia en función del voltaje (CNL) Ashmore 2008 Dallos & Fakler 2002 review 2000 2001 Ashmore 2009 La prestina es un transportador de aniones de la familia SLC26A5 Ashmore 2009 Hay 2 mecanismos propuestos para la amplificación sonora: electromotilidad somática de las OHCs y fuerza generada por los cilios Hackney y Fettiplace 2006 Respuesta de la MB a estimulación acústica en 17 KHz (CF). Las respuestas están normalizadas a la respuesta pasiva máxima Ashmore 2010 Amplificación y sintonización fina XBm = desplazamientos de la membrana basilar XHB = flexión del haz de cilios fHB= fuerza generada por los cilios debida al gating del mecanotransductor VOHC = cambio de voltaje en las OHCs fOHC = fuerza producida por el movimiento de las OHCs VTM/RL = velocidad relativa de los cilios de las IHCs entre la mb tectorial y la lamina reticular ABRs y Eos y DPOAES En el año 2002 generan un ratón knock-out de prestina Mediciones in vivo En el año 2008 generan un ratón con una modificación que anula la función de la prestina pero no su expresión V499G/Y501H 499 o Ki Registros con la técnica de “patch-clamp” en el modo “whole cell recording” en células ciliadas de las vueltas medio-apicales de la cóclea OHCs sIPSC eIPSC Vhold= -90mV Vhold= -40mV I. The biophysical and pharmacological profile of electrically evoked IPSCs in OHCs is consistent with α9α α10 nAChR + SK2 channel activation. I (pA) X X I (pA) Time (ms) Time (ms) Time (ms) II. The MOC-OHC synapse has a low quantal content Quantum content (m) = average number of vesicles released per AP sIPSCs 1 Hz - eIPSCs Results III. The MOC-OHC synapse presents paired pulse facilitation. 25 ms 50 ms I (pA) 10 ms Time (s) S2 S1 100 ms VI. Relative contribution of facilitation and summation during high frequency activity of MOC fibers. Summation: Constant P Summation & Facilitation: Variable P Experimental data oWe show that the strength of OHC inhibition changes with the frequency of MOC activation within their physiological firing range. oWe propose that short-term plasticity at the MOC-OHC synapse constitutes a mechanism by which OHCs encode MOC firing frequency to adjust the sensitivity of the auditory periphery. Brown 1998 Corrientes sinápticas prolongadas