FSN_Goutman_abr2016.pdf
Anuncio
Técnicas de imaging aplicadas a la neurociencia Juan D Goutman 18 de abril de 2016 FSN, FCEN, UBA Célula de Purkinje en el cerebelo Detección de Ca2+ con Fura-2 en células de Purkinje Así se ve en la realidad!!!! Tank et al., 1988 Science Identificación de células específicas en un tejido Identificación de interneuronas GABAérgicas en corteza de ratones López Bendito et al., 2004; Cerebral Cortex Usos de moléculas fluorescentes Identificar estructuras/células • Moléculas fluorescentes para identificar células: sintéticas (Alexa, Fluoresceina, Rhodamin) NF-H y macromoleculas (GFP, YFP, etc) (Alexa) M. Gómez-Casati Caracterizar procesos • Para identificar metabolitos: i) Ca2+, Mg2+, pH ii) sintéticas (fluo, fura, OGB) y macromoleculas (GCaMP) • Para medir voltaje (di-8-ANEPPS) Usos de moléculas fluorescentes Caracterizar procesos • Moléculas sensibles a la luz para modificar la actividad neuronal, concentración de metabolitos, otros: Fotólisis • Moléculas sensibles a la luz para modificar excitabilidad/inhibición En grupos de neuronas: OPTOGENÉTICA Incluso modular comportamientos animales!! Plan de la clase: 1. Introducción 2. Indicadores fluorescentes sensibles a potencial 3. Indicadores fluorescentes sensibles 2+ a Ca 4. Fotólisis 5. Optogenética 6. Resultados del lab Conceptos básicos de fluorescencia Diagrama de Jablonski Conceptos básicos de fluorescencia Diagrama de Jablonski - Foto-blanqueo (reducción en la intensidad de fluorescencia por sobre-estimulación) 2do fotón => fotoblanqueo - Quenching (reducción en intensidad por absorción de la energía) Precursores de la aplicacion de fluorescencia a la fisiología I Aequorin Sensible a Ca2+ Aequora victoria 1962 Osama Shimomura (Marine Biological Laboratory, Woods Hole, MA, EEUU) Aequorin Intensidad de fluorescencia (azul) de aequorin (sensible a Ca2+) Aequora victoria expresa dos tipos de proteínas fluorescentes: Aequorin y GFP!!! 2+ UV Ca Aequorin GFP Aequorin y GFP: un caso de FRET natural (Forster Resonance Energy Transfer) Ca2+ Aequorin GFP Roger Tsien: Premio Nobel de Química 2008 (junto a Osama Shimomura y Martin Chalfie Cambio de potencial y Ca2+ Baker, Hodgkin & Ridgway 1971 Hodgkin & Horowitz, 1959 1. Indicadores fluorescentes sensibles a potencial Indicadores fluorescentes sensible a potencial di-8-anepps 10 % de cambio en la señal cada 100 mV de DV Indicadores fluorescentes sensible a potencial Mutoh et al., 2012 2. Indicadores fluorescentes 2+ de Ca (Muchas veces como 'sensores' de voltaje) 1. Moléculas sintéticas 2. Moléculas codificadas genéticamente 3. Conceptos básicos y cinéticos Detección de Ca2+ con Fura-2 en células de Purkinje Así se ve en la realidad!!!! Tank et al., 1988 Science Precursores de la aplicacion de fluorescencia a la fisiología II BAPTA Fluoresceina y derivados| Fluorescein fue sintetizada por Adolf von Baeyer en 1871 Indicadores fluorescentes de Ca 2+ Fluo-3: BAPTA conjugado a un derivado de fluoresceina Oregon Green 488 BAPTA-1: BAPTA conjugado a un Oregon Green Fura2: Indicador 'ratiometrico' Rhod Ex 550 nm Em 580600 nm Coeficiente de extincion Rhod-2 570 nM 82000 Rhod-FF 19 mM 78000 Rhod-5N 320 mM 63000 Fluo Ex 490-500 Fluo-3 526 nM Fluo-5F 2.3 mM Oregon Green BAPTA Ex 488 Oregon Green BAPTA-1 170 nM Oregon Green BAPTA-2 580 nM Oregon Green BAPTA6F 3 mM Fura Ex 350 / 380 Fura-2 145 nM Fura-4F 770 nM Fura-6F 5.3 mM Quantum yield Em 515520 43000 0.14 Em 520 0.7 Em 420 LifeTechnologies.com Cómo introducir un indicador dentro de una célula/s? • A través de un electrodo de patch-clamp - Fácilmente controlable su concentración - Dialisa medio celular • Uso de moléculas modificadas con grupos AM (acetometil ester) - Bulk o local - No es posible controlar concentración de indicador - Medio celular parcialmente intacto 2. Indicadores fluorescentes 2+ de Ca 1. Moléculas sintéticas 2. Moléculas codificadas genéticamente 3. Conceptos básicos y cinéticos Genetically encoded Ca2+ indicators: GCaMP GCaMP1 Nakai et al., 2001 Nature Biotech Genetically encoded Ca2+ indicators: GCaMP GCaMP6 Reporteros leeeeentooooooos Chen et al., 2013 Nature Uso de GCaMP Silbering & Galizia, 2007 Alternativa!!! Laboratorio de Henry Markram, EPFL, Suiza. Ventajas y desventajas de indicadores sintéticos y geneticos Genéticos: 11-Expresión Expresióndireccionable. direccionable. Transgénicos Transgénicos(ojo (ojonivel nivelde deexpresión) expresión) In utero electroporation In utero electroporation Infeccion Infeccionviral viral 2Se mantiene 2- Se mantieneelelmedio mediointracelular intracelularintacto. intacto. OJO OJO 1-1-Difícil Difícildeterminar determinarconcentración concentraciónintracelular. intracelular. 2-2-Poca Pocavariedad variedadde deafinidades afinidadespor porCa Ca2+.2+. 3-3-Interfiere Interfiereen enlalacinética cinéticaintrínseca intrínsecade delalaseñal. señal. 33-Alta Altaestabilidad estabilidadpara paramediciones medicionesde delargo largo plazo. plazo. Sintéticos: 11-Gran Granabanico abanicode delongitudes longitudesde deonda onda 11-Mediciones Medicionescortas cortas(bleaching (bleachingyyotras) otras) 22-Gran Granvariedad variedadde deafinidades afinidades 22-Interfiere Interfiereen enlalacinética cinéticaintrínseca intrínsecade delala señal. señal. 3-”Baratos” 3-”Baratos” 2. Indicadores fluorescentes 2+ de Ca 1. Moléculas sintéticas 2. Moléculas codificadas genéticamente 3. Conceptos básicos y cinéticos Transientes de Ca2+ producidos por un PA o un tren resueltos con indicador de baja afinidad Oregon Green BAPTA 5N Nakamura et al., 2015 Neuron 2+ Dinámica del Ca intracelular Ca2+-OGB5 Ca2+-Buffer1 + OGB5 + Buffer1 Ca2+ “LIBRE” + Buffer2 Ca2+-Buffer2 Intracelular Extracelular Ca 2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ 2+ Dinámica del Ca intracelular Ca2+-OGB5 Ca2+-Buffer1 + OGB5 + Buffer1 2+ 2+ Los indicadores de Ca Ca son bufferes de Ca !!!! 2+ “LIBRE” + Buffer2 Ca2+-Buffer2 Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ 2+ Relación entre [Ca ] y fluorescencia En equilibrio: Kd 2+ Ca + F k+ Ca-F kEn equilibrio: kKdCa = k+ k- KdCa Afinidad k- KdCa Afinidad Ca2+ + F k+ k- Ca-F En el equilibrio: kKdCa = k+ [Ca][F ] KdCa = [CaF ] Importante!!: i) Medir DF fuera de la saturación del indicador ii) La relación entre la F y [Ca2+] es lineal SÓLO cuando [Ca2+] << Kd [Ca2+] = F-Fmin Fmax - F Valores de k+ y k- para algunos indicadores de Ca2+ Importante!!: i) Medir DF fuera de la saturación del indicador ii) La relación entre la F y [Ca2+] es lineal SÓLO cuando [Ca2+] << Kd [Ca2+] = F-Fmin Fmax - F Valores de k+ y k- para algunos indicadores 2+ de Ca Relativamente constante Dinámica intrínseca de indicadores de Ca Fluo-3 (>afinidad) 2+ Ca2+ uncaging: Genera una 'espiga' de Ca2+ [Ca2+] basal = 100 nM [indicador] = 100 mM CaOrange-5N (< afinidad) 2+ Ca + F k+ k- Ca-F Escobar et al., 1994 Transientes de Ca2+ producidos por un PA o un tren resueltos con indicador de baja afinidad Oregon Green BAPTA 5N Nakamura et al., 2015 Neuron Límite de difracción de un microscopio óptico Nakamura et al., 2015 Neuron Simon & Llinas, 1985 Resolution limit due to diffraction of Light Calibración de Fura-4F en set-up 10 mM EGTA Rmin ~ 0.5 10 mM HEDTA+1.8 mM Ca2+ R1mM ~ 1 10 mM Ca2+ Rmax ~ 10 [Ca]=Keff ∗( Grynkiewicz et al., 1985 R−Rmin ) Rmax−R Calibracion de fura4F en lab 3. Fotólisis Precursor fotolábil hn Ligando activo Fotólisis 1. Intracelular o Extracelular 2. Permite producir cambios muy rápidos de concentración de distintas especies 3. Inactivación de proteínas Fotólisis Fotólisis Compuestos comerciales para desenjaular: ATP IP3 Ca2+ GABA Glutamato Fotólisis de Ca 2+ DM-nitrophen (o Caged-Ca2+) Afinidad por Ca2+ cambia de 7 nM a 3 mM. Una difrencia de 105 Sensible a luz UV Fotólisis de Ca Heidelberger & von Gersdorff, 2005 2+ Fotólisis de Ca Schneggenburger & Neher, 2000 2+ Libros: Fundamentals of Light Microscopy and electronic imaging. Douglas Murphy. Willey-Liss inc. Imaging in Neuroscience and Development. A Laboratory Manual. Edited by R. Yuste & A. Konnerth Páginas web: Olympusmicro.com LifeTecnologies.com Papers: Neher, E. Cell Calcium (1998) 24, 345-357. Sala & Hernandez-Cruz (1990) Biophys J 57, 313-324 Escobar et al., (1997) Eur J Physiol. 434, 615-631 4. Optogenética Las estrellas de la optogenética Channelrhodopsin Halorhodopsin Alga Chlamydomonas reinardtii Retinal: Una “antena” para la luz hn Channelrhodopsin expresada en neuronas hipocampales Boyden et al., 2005 Nat Neurosci Métodos de estimulación neuronal antes (y después) de la optogenética - Fotólisis - aplicación de drogas Espectro y cinéticas de opsinas La optogenética consiste de: • Tecnología central para controlar excitabilidad neuronal con luz • Tecnología para dirigir luz de determinada longitud de onda en tejidos • Tecnología para dirigir la expresión de las proteínas de interés en las células de interés • Tecnología para obtener mediciones, realizar análisis, como imaging y electrofisiología Métodos de expresión de opsinas: I. Transgénicos Métodos de expresión de opsinas: I. Virus Fenno et al., 2011
