Teorica Labriola2016.pdf

Compartimentalización Celular
Retículo Endoplasmático
(RE)
Docente invitado: Dr. Carlos Labriola
CITOSOL
PEROXISOMAS
NÚCLEO
MITOCONDRIA
PLÁSTIDOS
RETÍCULO ENDOPLÁSMICO
GOLGI
ENDOSOMAS TARDÍOS
VESÍCULAS SECRETORIAS
LISOSOMA
ENDOSOMAS TEMPRANOS
MEMBRANA PLASMÁTICA
EXTERIOR CELULAR
Vía Secretoria
Retículo endoplásmico
ER rugoso
ER liso
El RE está formado por una red de tubos y sacos que se extiende
desde la membrana nuclear. Invaginación de la membrena plasmática.
El lúmen ocupa aprox. 10% volumen total. Topológicamente idéntico al
exterior.
Es una organela compleja y heterogénea donde se desarrollan
diferentes procesos:
- Síntesis de lípidos. ( ER liso )
- Reservorio de calcio. Ca++ alto
Entrada de las proteínas
- Síntesis de proteínas ( ER rugoso )
en la vía secretoria
Las proteínas que van al RE pueden ser:
* solubles o transmembrana.
* Residentes del RE o seguir la vía secretoria
Post-traduccional
Co-traduccional
VÍA SECRETORIA
Tienen el primer punto de sorting cuando están aún
siendo sintetizadas.
Proceso co-traduccional.
Como son dirigidas las proteínas al ER?
Los ribosomas son dirigidos a la mb del
ER por una
secuencia de aminoácidos presente en el extremo aminoterminal de la proteína (PEPTIDO SEÑAL) que está siendo
sintetizada y no por características propias de los mismos.
Aminoácido cargado
Aminoácidos hidrofóbicos
 Los péptidos señales son secuencias cortas (16-30)
que contienen un aa cargado seguido por un grupo de 6-12 aa
hidrofóbicos. Estos aa hidrofóbicos serían esenciales para la
unión a un receptor presente en la mb del ER.
Mecanismo de targeting formado por dos
componentes (SRP y el receptor en la mb).
SRP= Signal-Recognition Particula.
• El SRP es una RNP citosólica (6
Proteínas y un RNA) que une
simultaneamente al PS, al
ribosoma y al receptor en la mb
del ER.
• La P54 une el PS
• P9 y P14 interaccionan con el
ribosoma.
• P68 y P72 son requeridas para
la traslocación.
Los PS son todos distintos.
Como hace SRP para reconocer tantos?
Bolqueo del sitio de unión del
factor de elongación en el
ribosoma
Unión al PS
Bolsillo hidrofóbico
plástico
Proteínas requeridas
para la traslocación
Complejo Sec61
*complejo heterotrimérico
*pasivo
*interior acuoso
*se abre lateralmente
En el caso post-traduccional se asocian otras
proteínas.
Inserción de las proteínas en la membrana del ER
Las proteínas destinadas a la MP o mb de ER, Golgi o
lisosomas son incorporadas inicialmente a la mb del ER y
transportadas a los diferentes compartimientos como
componentes de mb.
La orientación de los diferentes fragmentos es
conservada durante todo el proceso, por lo tanto la
topología es determinada en el momento en que se
insertan a la mb del ER.
Segundo punto de sorting.
Los elementos que determinan su topología son los
segmentos transmenbrana (formados por segmentos de
20-25 aa hidrofóbicos) secuencias topogénicas.
Clasificación de las proteínas según su topología en IV clases
.
I,II y III comprende las proteínas de un único paso.
Tipo I: PS se cliva, N-term en el lumen, el C-term en citosol.
Tipo II: No PS que se clive, N-term en citosol, C-term en el lumen.
Tipo III: misma orientación que I pero sin PS clivable
Tipo IV :Proteínas multipaso numerosos segmentos transmembrana
Las proteínas solubles y de mb recientemente
sintetizdas tienen que realizar un proceso bastante
complicado en el RE:
PLEGARSE CORRECTAMENTE
Aquellas que no logren hacerlo, NO seguirán la
vía secretoria.
En el caso de multímeros, es aquí (RE) donde
se deben ensamblar los monómeros.
CONTROL DE CALIDAD
CITOSOL
PEROXISOMAS
NÚCLEO
MITOCONDRIA
PLÁSTIDOS
Paso limitante en la
vía secretoria
RETÍCULO ENDOPLÁSMICO
GOLGI
ENDOSOMAS TARDÍOS
VESÍCULAS SECRETORIAS
LISOSOMA
ENDOSOMAS TEMPRANOS
MEMBRANA PLASMÁTICA
EXTERIOR CELULAR
Anfinsen (1961): toda la información requerida por
la proteína para adoptar su configuración final está
codificada en su estructura primaria. (RNAasa A)
Paradoja
de
Levinthal
(1969)
:es
un
experimento mental
en la teoría de la dinámica
del plegamiento de proteínas. Señaló que, debido al
gran número de grados de libertad en una
cadena polipeptídica desplegada, la molécula tiene un
número astronómico de posibles conformaciones.
RNAasa A, 124 aminoácidos tiene 1050 conformaciones posibles. Si la molécula
pudiese probar una configuración cada 10-13 segundos, serían necesarios 1030 años
para probarlas todas. Sin embargo, se ha comprobado in vitro que la RNAsa se
pliega en aproximadamente 1 minuto.
In vitro
In vivo
Proteína incompleta
Proteína completa
Diferencia en la secuencia de eventos
 PROBLEMAS A RESOLVER: INTERACCIONES HIDROFOBICAS
-
ESTRUCTURA 3D MUY
BASICA DE UNA
PROTEINA
+
O
H -
H
O
+
+
UNA MICELA VENIDA
MUY A MAS
H
O -
+
O
H
-
PROBLEMA:
 SINTESIS PROTEICA Y TRASLOCACION DE MEMBRANAS ES LINEAL
LOS RESIDUOS HIDROFÓBICOS INTERACCIONAN INESPECIFICAMENTE
 LA VELOCIDAD DE SINTESIS MUCHAS VECES ES MENOR QUE EL
TIEMPO PARA EL PLEGAMIENTO
-
+
O
H
-+
-
O
H
+ -
O+
H
-
O
H
* a-hélices, b-turn (0.1 a10 mseg).
* Pequeñas proteínas (50 mseg).
* Estructuras mas complejas (b-sheet) (mas
lento).
* Dominios lo hacen en forma independiente.
La velocidad de síntesis juega
un rol importante.
NO HAY REGLAS GENERALES
PARA EL PLEGAMIEMTO.
CADA PROTEÍNA HACE LA SUYA.
PROCESO ASINCRÓNICO.
PROBLEMA ADICIONAL
EL MEDIO INTRACELULAR TIENE UNA
CONCENTRACION ESCANDALOSAMENTE ALTA
DE PROTEINAS !!!
E.coli ~ 150 mg/ml
Célula de mamífero ~ 180 mg/ml
PREVENIR LA SEGURA AGREGACION DE PROTEINAS,
SU CORRECTO PLEGADO Y ENSAMBLADO
PLEGAMIENTO ASISTIDO
CHAPERONAS y cochaperonas: proteínas que ayudan a otros polipéptidos
a adquirir la conformación apropiada o la localización celular adecuada sin
formar parte de la estructura final.
INTERACCIONAN CON RESIDUOS HIDROFOBICOS (previniendo
agregación)
FOLDASAS
 PDI: protein disulfuro isomerasas: CATALIZAN LA CORRECTA
FORMACION DE PUENTES DISULFURO.
 PPIases: peptidilprolil isomerasas: CATALIZAN LA ISOMERIZACION
DE PROLINAS.
LECTINAS y enzimas proecesasdoras de glicanos: INTERACCIONAN CON
HIDRATOS DE CARBONO.
 CRT/CNX: calreticulina / calnexina/ GI/GII/GT etc
BASES DEL PLEGAMIENTO IN VIVO DE PROTEINAS






Secundaria
Terciaria
Cuaternaria
Puentes disulfuro
Isomerizacion de prolinas
Modificaciones postraduccionales
“VIA TERMODINAMICA”
“VIA CINETICA”
Reacción de molecularidad alta.
Muy dependiente de concentración
“VIA TERMODINAMICA”
“VIA CINETICA”
HSP70 del RE (BiP) presenta dos conformaciones:
ABIERTA: en presencia de ATP, alta velocidad de entrada y salida.
CERRADA: en presencia de ADP o sin nucleótido unido, entrada y salida lenta.
 La unión del sustrato está estimula la hidrólisis de ATP.
DnaJ
ATP
ATP
ATP
ADP
GrpE
La clave es que la unión de ATP aporta la energía para romper los contactos entre la
chaperona y el sustrato mal plegado. Esto es algo general de todas las “holdasas”.
LA CHAPERONA LO UNICO QUE HACE ES UNIR Y SOLTAR EL SUSTRATO, en un
proceso acoplado a la hidrólisis de ATP.
NO PLIEGA A LA PROTEINA DE FORMA “ACTIVA”. La consecuencia principal de su
acción es evitar interacciones inespecíficas del sustrato con el entorno.
Recuerden que la agregación es MUY dependiente de la concentración de proteína
libre.
CHAPERONAS
OBSERVACIONES GENERALES
• EN GENERAL NO ACELERAN LA VELOCIDAD DE PLEGAMIENTO.
AUMENTAN LA EFICIENCIA DEL PROCESO AL EVITAR LA AGREGACION
Y RESCATAR PROTEINAS QUE ENTRARON EN VIAS MUERTAS
• DURANTE EL PLEGAMIENTO IN VIVO UNA PROPORCION MUY
VARIABLE DE UNA PROTEINA PARTICULAR INTERACCIONA CON LOS
SISTEMAS DE CHAPERONAS. Dicha proporción depende de las necesidades
particulares de cada sustrato y de cuán complejo sea su plegamiento.
• LAS PROTEINAS PUEDEN SEGUIR MAS DE UNA VIA DE PLEGAMIENTO
IN VIVO. AL ELIMINARSE LA INTERACCION CON UNA CHAPERONA EN
PARTICULAR OTRAS TOMAN SU LUGAR
A nivel de organismos unicelulares la eliminación de una chaperona raramente
es letal. A medida que la complejidad biológica aumenta comienzan a ser
letales.
¿Cómo medimos la actividad de una chaperona?
OD 360 nm
> cc chaperona
Tiempo
 Se usan sustratos que agregan a baja temperatura (citrato
sintetasa, insulina, etc)
Ejemplo:
Sustrato: IgY de gallina
Chaperona: calreticulin
∆ [Ca2+] = 1 mM
□ [Ca2+] = 10 mM
 [EGTA] = 10 mM
- CRT
+ CRT
Oxidación
Reducción
Puente disufuro
 PROBLEMAS A RESOLVER: PUENTES DISULFURO
SH
1
S-S (1-2)
SH
2
S
3
S
SH
SH
SH
S
S
SH
S-S (2-3)
S S
NATIVA
E0S-S(2-3)  E0S-S(2-1), E0S-S(13)
Y además hay una barrera
cinética mayor para abrir
este puente
S-S (1-3)
…Y A MEDIDA QUE AUMENTA EL NUMERO DE CYS LA PROBABILIDAD DE
FORMAR LA COMBINACION ADECUADA DE PUENTES S-S ES CADA VEZ MENOR:
4 S-S: 105 posibilidades (RNAsa)
5 S-S: 945 posibilidades
6 S-S: 10395 posibilidades
7 S-S: 135135 posibilidades (PLA2)
FORMACION DE PUENTES DISULFURO: PDI
MAQUINARIA DE RECICLADO
CITOSOL:
[GSH] : [GSSG] = 30:1 A 100:1
PDI
PDI
PDI
S
S
S
SH
SH
SH
SH
SH
S
SH
S
S
PROTEÍNA
PROTEÍNA
RETICULO ENDOPLASMICO:
[GSH] : [GSSG] = 1:1 A 1:3
PROTEÍNA
LA PDI “NO SABE” SI UN PUENTE
DISULFIRO ES CORRECTO. HAY UN
JUEGO ENTRE ESTABILIDAD Y
CINETICA.
S-S (1-2)
S-S (1-3)
S-S (2-3)
¿COMO SE GENERAN LOS S-S?
LUMEN RE
CITOSOL
Ero1p
FAD FAD
PDI
SH
S
SUSTRATO
S
SH
S
S
Accred/H2O2
Accox/O2
FAD FAD
FAD
FAD
SH
SH
SH
SH
SH
SH
ROS
Las PDIs cumplen varias funciones:
HS
S
E
HS
S
S
HS
OXIDO-REDUCCION
OXIDO-REDUCCION
SH HS
E
S
S
S
HS
S
SH
E
SH
S
HS
SH
S
E
ISOMERIZACION
SH
HS
S
S
S
Y están altamente especializadas a determinados sustratos. En el RE hay unas 18 PDIs distintas.
Si uno expresa una PDI con la cisteína resolutiva
mutada puede congelar los heterocomplejos.
Ej.: sobre-expresión de ERp57 silvestre o de una
mutante y WB anti ERp57
E
A HS
S
S
S
HS
Para detectar heterocomplejos de PDI con sus
sustratos se realizan geles bidimensionales en
donde la primera dimensión se hace en condiciones
no reductoras y la segunda dimensión en
condiciones reductoras:
PROLINA
ISOMERIZACIÓN
 PROBLEMAS A RESOLVER: ISOMERIZACION DE PROLINAS
 PPIases: peptidilprolil isomerasas.
TRANS
CIS
Quimotripsina
Ala-Ala-Pro-Phe
Muestra a ensayar
+
Ala-Ala-Pro-Phe
Degradación casi total
Quimotripsina
Casi no hay
degradación
¿PORQUE LAS PROTEINAS SE GLICOSILAN?
Propiedades biofísicas
 DEBIDO A SU NATURALEZA HIDROFILICA AUMENTAN LA SOLUBILIDAD DE
LAS PROTEINAS
 POR SU GRAN VOLUMEN REDUCEN LA EXPOSICION SUPERFICIAL DE LA
PROTEINA, DISMINUYENDO LOS CONTACTOS INESPECIFICOS ENTRE
PROTEINAS
 LOS OLIGOSACARIDOS POR LO GENERAL ESTABILIZAN EL BACKBONE
 MODULAN LA ESTRUCTURA LOCAL
¿PORQUE LAS PROTEINAS SE GLICOSILAN?
Propiedades biológicas
 DESTINO INTRACELULAR DE PROTEINAS
 MOTILIDAD CELULAR
 RECONOCIMIENTO CELULA-CELULA
 RESPUESTA INMUNE
 SE USAN COMO UN CODIGO DE BARRAS PARA INDICAR EL ESTADO
CONFORMACIONAL DE LA PROTEINAS
Oligosacárido
Pueden ser ramificados
Aproximadamente el 80% de las proteínas sintetizadas y
translocadas al RE poseen en su secuencia un sitio de NGlicosilación
Asn
X
Ser/Thr
NH2
COOH
El mismo oligosacárido
es transferido en el RE
de mamíferos, levaduras
y plantas.
3 X Glc
9 X Man
2 X GlcNAc
Asn
X
Ser/Thr
Síntesis del Dol-PP-oligosacárido
Supercomplejo Translocon-OST
G3 M9
Glucosidasa I
G2 M9
Glucosidasa II
G1 M9
UDP-Glc glicop.Glucosiltransferasa
GT
M9
Asn
Glc
GT
UDPG
GT
UDPG
UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (UGGT)
 Reacción
Man7-9GlcNAc2-Prot + UDP-Glc
Glc1Man7-9GlcNAc2-Prot + UDP
 Requerimientos
1-5 mM Ca2+
Neutral pH
Glicoproteína en una conformación nonativa
 Propiedades
Específica por UDP-Glc
Aprox. 1600 aminoácidos
Soluble en lumen de RE
KDEL-like secuencia de retención en C-terminal
MODELO EXPERIMENTAL :
INHIBIDOR DE QUIMOTRIPSINA 2 (CI2)
64 residues
1 tritofano (TRP5)
Soluble !
MUY ESTUDIADA
Pero .… no es una
glicoproteína
Qué reconoce la GT?
Qué intermediarios son mejores
sustratos?
 Lectinas residentes del RE específicas para GlcNAc2ManXGlc :
CALRETICULINA (CRT): soluble en el lumen
CALNEXINA (CNX): integral de membrana de tipo I
CRT / CNX
CRT
GI
G II
G II
GT
GOLGI
G II
RE
Cit
CNX
T. cruzi
DNJ (1-deoxinojirimicina)
GT
G II
Cruzipaína (CZ)
*Cisteína proteinasa (glicoproteína).
*Alta manosa (glucosilada por GT).
*Muy abundante.
*Lisosomal.
*Fácil de purificar.
*Anticuerpos.
1-
169
292
377
- 467
Sobrenadante 1
(Citosol y lisosoma)
-20oC 24 h
buffer (sin detergente)
centrifugación
parásitos
buffer (con detergente)
centrifugación
Precipitado (descarte)
Sobrenadante 2
(Microsomas)
PULSO Y CHASE
WESTERN BLOTS
INMUNOPRECIPITACION
RE
DNJ
Lisosoma
La retención de la Glc
retrasa la llegada de CZ a
su destino
RE
Y
CRT
DNJ
CZ
CRT
DNJ promueve la unión de
CRT a CZ
CRT se comporta exclusivamente como lectina
Y
CRT
Endo H
G2M9
G1M9
M9
CRT recom.
T. cruzi
GT
G II
RE
Y
CRT
CRT no interacciona con
CZ no glucosilada
Chase (min)
5
15 30 60
90 120
wt –DNJ
wt +DNJ
gt- +DNJ
gt- –DNJ
En parásitos nulos en GT, CZ retrasa su llegada a lisosoma
IP: a-CZ
RE
WB: a-BiP
CRT
Bip
La ausencia de GT, prolonga
la interacción Grp78/BiP - CZ
IP: a-CZ
ER
CZ
Lisosomas
CZ
En ausencia de GT, CZ se retiene en el RE en sus formas mas
desplegadas
BiP
CRT
CZ
CZ
CZ
BiP interacciona con CZ en los primeros estadíos de plegamamiento y
CRT con los estadíos mas avanzados.
SH
SH
SH
HS
SH
SH
HS
SH
En ausencia de GT, CZ forma agregados covalentes.
WT
-SH
-SH
BiP
BiP
BiP
CRT
GT
CRT
G II
-S-S-S-S-
GT -
-SH
-SH
BiP
BiP
BiP
CRT
GT
G II
-S-S-S-S-
Agregados covalentes
 BiP y CRT se complementan para asistir durante toda la
maduración de CZ
 BiP no puede suplantar a CRT
 UGGT funciona principalmente durante las atapas
avanzadas del plegado
Que ocurre cuando la maquinaria de plegamiento es superada?
En RE:
1) ATENUAR SINTESIS DE PROTEINAS
UPR
2) SINTETIZAR MAS CHAPERONAS
3) DEGRADAR PROTEINAS MAL PLEGADAS
4) APOPTOSIS
ERAD
ERAD: ER associated degradation
a 1,2 manosidasas
Demanosilación progresiva
Se debilita la interacción con CRT/CNX
Mejor sustrato para GII
Peor sustrato para GT
Se interrumpen los intentos de plegado.
ERAD
ERmanI y EDEM
Si la cantidad de proteínas a plegar excede la maquinaria de
plegamiento se activan 3 proteínas transmembrana residentes
en el RE:
• ATF6 : Activating transcription factor.
• IRE 1: Inositol requiring kinase
• PERK: double-stranded RNA-activated protein kinase (PKR)like endoplasmic reticulum kinase.
Proteína Transmembrana tipo II.
Leucine zipper.
En el Golgi, el N-t es cortado por una metaloproteasa.
El dominio citosólico transloca al nucleo (factor de transcripción).
BiP
CRT
Fosforilación de la subunidad alfa del factor 2 de iniciación de la
traducción (eIF2a)
¿Qué ocurre cuando una proteína no puede plegarse correctamente y no es
degradada?
FORMA AGREGADOS: CUERPOS DE INCLUSION, AGRESOMAS, AMILOIDES
ESTOS AGREGADOS PUEDEN SER DELETEREOS
ENFERMEDADES DE PLEGAMIENTO
MAL DE ALZHEIMER (2.000.000 EN USA)
MAL DE PARKINSON (500.000 EN USA)
ENFERMEDADES POR POLIGLUTAMINAS (HUNTINGTON, KENNEDY, ATAXIA,
ETC)
MAL DE LA VACA LOCA (BSE)
… y la lista es muy larga