MEDOZA_DARLY_EFECTO_INCUBACION_FORMACION_MARCO_TEORICO.pdf

I.
INTRODUCCIÓN
Actualmente la seguridad alimentaria plantea problemas como la adhesión
de los microorganismos a las superficies, lo que se conoce como biofilms
uno de los campos en el ámbito alimentario más importantes a tratar. El
término biofilms fue introducido en el año de 1978 según Costerton (1999).
Costerton dirige el Centro para la Ingeniería del Biofilm en la Universidad del
Estado de Montana. Este centro fue fundado en el año 1990 para recoger y
estudiar
las
diversas
y
sorprendentes
apreciaciones
que
iban
descubriéndose, por parte de equipos multidisciplinares de ingenieros,
biólogos, químicos y especialistas en medio ambiente. Según Costerton
(1995); Davey y O’Toole (2000); Kraigsley y otros (2002), los biofilms son
comunidades complejas de microorganismos y polímeros extracelulares, fijas
a una superficie, que pueden presentar una única especie o diferentes
especies.
Aunque la composición de los biofilms es variable, en general, el
componente mayoritario es el agua, que puede representar hasta un 97 %
del contenido total. Además de agua y de las células bacterianas, la matriz
de los biofilms es un complejo que está formado principalmente por
exopolisacáridos (Sutherland, 2001). En menor cantidad se encuentran otras
macromoléculas como proteínas, ADN y diversos productos procedentes de
la lisis de las bacterias (Branda y otros 2005).
Según Pedersen (1990), las bacterias son capaces de formar biofilms sobre
muchas superficies, la capacidad de unirse a diversos plásticos, cristal y
metales, depende de las proteínas específicas de su cubierta. Los estudios
muestran que el acero inoxidable puede ser tan susceptible como el plástico.
2
Estudios realizados en botellas de agua mineral muestran que las superficies
lisas de las botellas de PET (tereftalato de polietileno) apenas eran
colonizadas por bacilos mientras que las superficies más rugosas e
hidrofílicas del
PEAD (polietileno de alta densidad) de los tapas eran
pobladas por grupos de cocos (Chmielewsky y Frank, 2003).
La formación de biofilms no parece estar restringida a ningún grupo
específico de microorganismos y hoy se considera que, bajo condiciones
ambientales adecuadas, todas las bacterias son capaces de formarlos.
Podemos encontrar biofilms en todos los medios donde existan bacterias: en
el medio natural, clínico o industrial. Sólo necesitan un entorno hidratado y
una mínima presencia de nutrientes (Donlan, 2002) y (Lasa y otros, 2009).
Según González (2005), si bien son numerosas las especies susceptibles de
formar biofilms en la industria de producción de alimentos se citan a
continuación algunas de especial importancia en relación con la seguridad
alimentaria: Listeria monocytogenes, Salmonella spp, Escherichia coli,
Pseudomonas spp, Campylobacter jejuni, Bacillus spp, Staphylococcus
aureus.
En la industria alimentaria es muy común la presencia de biofilms en
diferentes superficies, en conducciones, equipos y materiales y así se
pueden observar en industrias lácteas, fábricas de cerveza, etc. Su presencia
puede ser perjudicial e indeseable puesto que en muchos casos producen
contaminaciones del producto acabado lo que se traduce en una disminución
del periodo de conservación e incluso en una transmisión potencial de
enfermedades alimentarias (Serra, 2003) (Fuster i Valls, 2006).
3
El problema planteado para esta investigación fue:
¿Cuál será el efecto del tipo envase (Polietileno tereftalato y polietileno de
baja densidad) y tiempo de incubación (6, 12, 24 y 48 horas), sobre la
formación de biofilms bajo condiciones in vitro de bacterias de interés
alimentario (Salmonella spp, Escherichia coli ATCC 35218, Staphylococcus
aureus ATCC 25923)?
Los objetivos propuestos fueron:
Evaluar el efecto del tipo de envase y tiempo de incubación sobre la
formación de biofilms bajo condiciones in vitro de bacterias de interés
alimentario.
Determinar el tiempo de incubación y tipo de envase que permita la
mayor formación de biofilms bajo condiciones in vitro de bacterias de
interés alimentario.
4
II.
REVISION BIBLIOGRAFICA
2.1 Los biofilms
Según Donlan (2002), realizó una descripción ampliamente aceptada de los
biofilms, estableciendo lo siguiente: Los biofilms se definen como una
comunidad microbiana sésil y que pueden presentar una única especie
microbiana o varias especies diferentes, caracterizada por células que están
adheridas irreversiblemente a un substrato o interfase, encerradas en una
matriz de sustancias poliméricas extracelulares que ellas han producido, y
exhiben un fenotipo alterado en relación con la tasa de crecimiento y
trascripción génica.
2.2 Composición de los biofilms
Toda comunidad microbiana desarrollada en biofilm es única en su género,
aunque
algunos
atributos
estructurales
pueden
considerados universales.
En el Cuadro 1 se muestra la composición de los biofilms.
generalmente
ser
5
Cuadro 1. Composición de los biofilms.
Composición de los biofilms
Agua 97 %, células bacterianas 15 a 20 %, elementos de lisis bacteriana.
Exopolisacáridos (EPS): Componente fundamental producido por las
propias bacterias.
En menos cantidad: Sustancias
polimétricas extracelulares (SPE)
compuestas por proteínas ácidos nucleicos y polisacáridos
Material no bacteriano: cristales de sales minerales partículas de corrosión
y/o sedimento o componentes sanguíneos según el medio donde se
desarrolla el biofilms.
Los EPS pueden tener carga neutra o carga polianiónica según el
exopolisacárido que le permite interactuar con diferentes antimicrobianos
sin capacidad de actuar sobre las bacterias.
Fuente: Donlan (2002), Chole y Faddis (2003).
2.3 Factores que influyen en el desarrollo del biofilms
Según González (2005); Fuster y Valls (2006), existen varios factores que
afectan al desarrollo de los biofilms como son:
Las propiedades de las superficies de contacto.
El tiempo de contacto.
Las características de la superficie celular.
La disponibilidad de nutrientes.
La composición de la comunidad microbiana.
La disponibilidad de agua.
6
2.3.1 Las propiedades de las superficies de contacto
El tipo de sustrato influye en las características de la unión. Las bacterias
tienden a unirse a las superficies hidrófilas uniformemente en una capa,
mientras que en el caso de las superficies hidrófobas tienden a unirse en
grupos Fuster y Valls (2006).
González (2005), en algunos trabajos ha demostrado que las bacterias
quedan retenidas en las imperfecciones de las
superficies; además, las
superficies rugosas son más difíciles de limpiar y acumulan suciedad
permitiendo que las bacterias vuelvan a multiplicarse.
Según Fuster y Valls (2006), demostraron que los niveles de higiene en las
superficies de contacto podían verse disminuidos con el uso y provocar que
la superficie se deteriorase. Los defectos de las superficies pueden actuar
como puntos de retención de microorganismos y materia orgánica. En
consecuencia, los defectos de las superficies proporcionan inseguridad a la
suciedad
y
los
microorganismos,
lo
que
hace
que
las
bacterias
supervivientes puedan volver a multiplicarse y formar un biofilm.
2.3.2 El tiempo de contacto
Un mayor tiempo en contacto (exposición) entre las células y el sustrato
permite que se establezca un mayor
número de uniones haciendo la
adhesión irreversible, y por tanto, factores, como las condiciones
ambientales, tipo de microorganismo, sustrato y presión en el caso de
superficies de trabajo o utensilios, pueden también influir de manera
importante en la mayor posibilidad de formación de biofilm Pérez-Rodríguez
y otros (2008).
7
2.3.3 Las características de la superficie celular
Las características de la superficie celular como los flagelos, pili, proteínas
de adhesión y cápsulas ejercen también su influencia. Los pilis actúan como
un velcro para anclar las bacterias a algunas superficies y también actúan
como quimiorreceptores, dirigiendo a la bacteria hacia a algunos sitios
específicos. La pérdida de estos apéndices cambia las propiedades de
superficie de la bacteria, lo que puede provocar una menor capacidad de
adhesión. También se conoce que las esporas se adhieren mejor a la
superficie que las células vegetativas debido al grado de hidrofobicidad de su
superficie González (2005).
2.3.4 La disponibilidad de nutrientes
La disponibilidad de nutrientes ejerce una influencia mayor sobre la
estructura y composición de biofilm. Estudios realizados sobre biofilms de
Listeria spp. han puesto de manifiesto que niveles bajos de fosfatos
estimulan el desarrollo de biofilms, aunque el efecto se reducía después de
varios días Chmielewsky y Frank (2003). Asimismo su desarrollo depende
también del tipo de azúcar utilizado, siendo la trehalosa y manosa las que
proporcionan un nivel más pobre de formación de biofilms.
2.3.5 La composición de la comunidad microbiana
Los biofilms multiespecies son más gruesos y estables frente al estrés
ambiental que los monoespecies. En una superficie, el grosor medio de los
biofilms de Klebsiella pneumoniae y P. aeruginosa monoespecie son de 15 y
30 µm respectivamente, mientras que un biofilm formado por ambas
especies bacterianas presenta un grosor de 40 µm (Kumar y Anand, 1998).
Esto se atribuye a la secreción combinada de las distintas sustancias
poliméricas extracelulares resultantes de los diferentes microorganismos
Chmielewsky y Frank (2003).
8
La implicación de la diversidad microbiana en los biofilms relacionados con la
industria alimentaria no se ha determinado, ya que la mayoría de los estudios
están focalizados hacia biofilms en aguas y sistemas de agua residuales. En
una planta de procesado existen lugares como los desagües del suelo que
son proclives a la formación de biofilms multiespecie debido a su alta
diversidad bacteriana y otras, como una placa de calor, propicias a la
formación de biofilms monoespecies Chmielewsky y Frank (2003).
Se ha observado la asociación de varias especies patógenas, incluyendo S.
aureus, L. monocytogenes, Campylobacter spp., E. coli O157:H7, V. cholerae
y Helicobacter pylori, en la formación de biofilms multiespecie. A pesar de
que todas ellas son capaces de adherirse a una superficie y comenzar el
crecimiento, la mayoría no tiene capacidad por si sola de completar el
desarrollo del biofilm. Cada vez se tiene más la percepción de que los
biofilms son comunidades biológicas heterogéneas que se adaptan a la
evolución de las condiciones ambientales y a la composición de la
Comunidad Donlan (2002).
2.3.6 La disponibilidad de agua
Pérez-Rodríguez y otros (2008), la disponibilidad de agua es un factor crucial
para la viabilidad del biofilm. Una humedad relativa en torno al 90-100 %
posibilita el desarrollo del biofilm, por ello la mayoría de los biofilms se
encuentran en ambientes acuosos como pueden ser los sistemas de
conducción o tuberías de las industrias lácteas.
Sin embargo, también se ha encontrado que valores en torno al 70-80 %
humedad relativa pueden ser suficientes para permitir el desarrollo del biofilm
Keskinen y otros (2008) indicando que ambientes con humedad relativa alta
pueden incrementar significativamente el riesgo de su aparición. La
9
temperatura es un factor también determinante y a la vez relacionado con la
humedad relativa, ya que se ha observado que valores en el rango 20-30 ºC
incrementan la probabilidad de formación del biofilm, mientras que valores
por encima de este rango inciden negativamente sobre ese proceso Else y
otros (2003).
En el Cuadro 2 se muestran alguna de las variables más importantes que
intervienen en el proceso de adherencia y crecimiento de los biofilms.
Cuadro 2. Variables más importantes en el proceso de adherencia y
crecimiento de los biofilms.
Propiedades
de la
Propiedades de la
Propiedades del fluido
bacteria
superficie
Textura
Velocidad del flujo
Hidrofobicidad
Hidrofobicidad
pH
superficie celular
material
Temperatura
Fimbrias
Cationes
Flagelos
Presencia de antimicrobianos
Sustancias extracelulares
poliméricas
Fuente: Donlan (2002).
de
la
10
2.4 Quorum Sensing (QS) en los biofilms
Según Donlan (2002); Lasa y otros (2009), es un mecanismo de
comunicación entre bacterias que permite la formación de biofilms. El
lenguaje usado para la comunicación intercelular es basado en pequeñas
moléculas generadoras de señal llamadas autoinductores.
El proceso quorum sensing funciona debido a que cada bacteria que se une
a una superficie produce una molécula señal “yo estoy aquí”, de manera tal
que mientras más bacterias se unen, se incrementa la concentración local de
esta señal.
El sistema de QS es un mecanismo de regulación dependiente de la
acumulación en el medio ambiente de una molécula señal, autoinductor, que
permite a la bacteria sentir la densidad de la población existente. En
bacterias
Gram
homoserinalactona,
negativas
mientras
el
principal
que
en
autoinductor
bacterias
Gram
es
la
positivas
acillos
autoinductores suelen ser de naturaleza peptídica Donlan (2002); Lasa y
otros (2009).
2.5 Proceso de formación de los biofilms
El desarrollo de un biofilm es una forma habitual de crecimiento de las
bacterias en la naturaleza. En la actualidad se considera que en condiciones
ambientales adecuadas, la mayoría de los microorganismos son capaces de
formar biofilms Donlan, (2002); Lasa y otros (2009). El ciclo vital de los
biofilms es un proceso dinámico que puede ser dividido en 3 fases:
Adhesión
Crecimiento
Separación o desprendimiento.
11
2.5.1 Fase de adhesión
La adhesión de la bacteria a la superficie es un proceso rápido que con
frecuencia se produce entre 5 y 30 segundos según González (2005).
Durante esta fase las bacterias una vez percibida una superficie o sustrato,
proceden a formar una unión activa vía apéndices, como fimbrias, flagelos o
pili. Mediante microscopía electrónica se ha descrito que las bacterias
adheridas se encuentran conectadas a la superficie por medio de finas
fibrillas poliméricas extracelulares. Las fimbrias, probablemente luego de
superar la barrera de repulsión electroestática inicial que existe entre el
germen y el sustrato, contribuyen a la adhesión bacteriana Donlan (2002);
Ramadan y otros (2005).
En la adhesión las bacterias sintetizan la matriz de exopolisacáridos para
establecer un contacto físico entre ellas y la superficie. Durante este proceso
las bacterias cambian su fenotipo y llegan a ser básicamente diferentes
respecto a su forma planctónica. Este cambio implica la expresión de genes
específicos, se producen variaciones y alteraciones en su morfología y
cambia su tasa de crecimiento según Donlan y Costerton (2002);
Chmielewsky y Frank (2003).
La utilidad de la matriz es retener el agua y los nutrientes y proteger a las
células de los cambios del ambiente y del ataque de los antibióticos y
biocidas Sutherland, 2001), (Donlan, 2002).
2.5.2 Fase de crecimiento
En esta segunda fase, una vez que la bacteria se ha adherido a la superficie,
comienza a dividirse y las células bacterianas hijas se extienden alrededor
del sitio de unión, formando una microcolonia similar a como sucede durante
12
el proceso de formación de colonias en las placas de medios con agar
(Kumar y Anand, 1998); (Lasa y otros, 2009).
Si las condiciones son adecuadas para un crecimiento suficiente del biofilm
se desarrollará una estructura organizada, a este proceso se le denomina
maduración. Un biofilm maduro puede consistir en una simple capa de
bacterias. Este desarrollo y maduración del biofilm depende de factores
como la disponibilidad de nutrientes, la diversidad microbiana de la
comunidad, la disponibilidad de agua y el transporte celular según
Chmielewsky y Frank (2003).
A medida que madura el biofilm, se va adaptando a la presencia de
nutrientes, al oxígeno y a los cambios poblacionales formando microcolonias
discretas separadas por canales de agua. El número de bacterias viables se
reduce con la edad del biofilm; así en un biofilm joven se han detectado
cerca de un 80 % de células bacterianas viables, y tan solo un 50 % en un
biofilm maduro (Branda y otros 2005); (Fuster y Valls, 2006).
2.5.3 Fase de separación
Según Donlan (2002); Lasa y otros (2009), nos dice que finalmente en la
tercera fase, algunas bacterias de la matriz del biofilm se liberan del mismo
para poder colonizar nuevas superficies cerrando el proceso. La liberación de
las bacterias desde el biofilm es la parte del proceso que menos se conoce.
Se puede deber a modificaciones internas en la estructura del biofilm o
producirse por actuación de fuerzas físicas.
13
2.6 Envases de plásticos
El plástico es un material que se obtiene a partir del petróleo, los plásticos
son materiales formados por polímeros y aditivos, que combinados en
distintas proporciones presentan propiedades diferentes. Los envases de
plásticos se utilizan para ayudar en el transporte, como protección de los
productos en los almacenes y para comunicar información al consumidor. El
uso de envases plásticos en la industria alimentaria debe asegurar su
inocuidad para no transmitir algún riesgo al alimento según Marriott (1999).
En general, debe cumplir con ciertas características que le permitan ejercer
sus funciones básicas: protección, funcionalidad y motivación. La protección
se relaciona con la capacidad que tiene el envase de mantener al producto
en condiciones óptimas, de tal manera que no se modifiquen sus
propiedades; o en el caso de los alimentos que no se altere su estabilidad, ya
sea protegiéndolo del medio ambiente o del mismo envase como tal. La
funcionalidad toma importancia desde el punto de vista del manejo
productivo y disposición del producto, así como el facilitar su identificación y
ubicación en un lugar determinado. La motivación se relaciona con la forma
como se ofrece el producto al consumidor, así como con su promoción y
proyección frente al mercado (Marriott, 1999).
Existen varios tipos de envases, de diferentes materiales, que buscan
cumplir con estas tres funciones. Entre ellos se encuentran los envases de
plástico formados principalmente por resinas o residuos de polímeros, como
polietileno de baja densidad (PEBD), polietileno tereftalato (PET), y cloruro
de polivinilo (PVC). La importancia de los envases utilizados en la industria
farmacéutica, de cosméticos y de alimentos, radica principalmente en la
calidad integral con la que son diseñados y elaborados, así como en la
capacidad de protección que ellos ofrecen a los productos envasados,
14
protección que debe ser considerada dentro del diseño de los productos,
garantizando de esta manera su estabilidad (Ficha de datos de seguridad,
2008).
2.7 Identificación de los materiales de plásticos a través de sus códigos
Los plásticos tienen códigos para facilitar su identificación y sus
características tal como se observa en el Cuadro 3.
Cuadro 3. Nombre, sigla, símbolo y número de los materiales de
plásticos.
Nombre
Siglas
Polietileno tereftalato
PET
Polietileno de alta densidad
PEAD
Cloruro de polivinilo
PVC
Polietileno de baja densidad
PEBD
Polipropileno
PP
Poliestireno
PS
Otros plásticos
-
Fuente: Acoplasticos (2002).
Símbolo y número
15
2.8 Tipos de envases de plásticos utilizados en la industria alimentaria
Los plásticos que hoy en día utilizamos, son económicos, livianos,
transparentes y nos hace más práctica la vida. Sin embargo los plásticos
más comunes que usamos cotidianamente y que emplearemos para este
estudio son: Polietileno tereftalato (PET) y polietileno de baja densidad
(PEBD) ya que estos son los más utilizados en la industria alimentaria.
2.8.1 Polietileno tereftalato
Se produce a partir del ácido tereftálico y etilenglicol, por poli condensación;
existiendo dos tipos: grado textil y grado botella. Para el grado botella se lo
debe post condensar, existiendo diversos colores para estos usos
(Tecnología en Comunicación Visual II., 2006).
Las aplicaciones que se da son envases para gaseosas, aceites, agua
mineral, frascos varios (mayonesa, salsa, etc.), fibras textiles, laminados de
productos alimenticios, envases al vacío, bolsas y bandejas para
microondas, cintas de video y audio, películas radiográficas (Tecnología en
Comunicación Visual II., 2006).
Algunos beneficios: transparente, irrompible, liviano, impermeable, atóxico,
inerte (al contenido) (Tecnología en Comunicación Visual II., 2006).
16
2.8.2 Polietileno de baja densidad
Se produce a partir del gas natural es de gran versatilidad y se procesa de
diversas formas: inyección, soplado, extrusión.
Su transparencia, flexibilidad, tenacidad y economía hacen que esté presente
en una diversidad de envases, sólo o en conjunto con otros materiales y en
variadas aplicaciones. Es flexible, la superficie es encerada; se puede
colorear ya que tiene un color blanquecino (Tecnología en Comunicación
Visual II., 2006).
La diferencia estructural química ente los dos tipos de envase el PET y
PEBD, el primero posee un anillo aromático bencénico con enlaces doble y
segundo posee solo carbono e hidrogeno con enlaces simples (Jaramillo,
2001)
El contenido microbiano del material del envase depende de su composición
y de las condiciones de almacenamiento. Los envases de plásticos
usualmente poseen un bajo número de microrganismo como resultado de un
mal almacenamiento. Por otra parte, el almacenamiento y transporte de los
envases plásticos en condiciones de poco higiénicas puede ser un factor que
incrementa el número de contaminantes.
Algunas aplicaciones son envases de todo tipo: supermercados, boutiques,
congelados, industriales, etc.; recubrimiento de acequias; envasado para
medicamentos, alimentos y productos industriales, pañales descartables;
bolsas para suero (Tecnología en Comunicación Visual II., 2006).
17
2.9 Formación de biofilms por patógenos alimentarios
A pesar de que la mayoría de las especies bacterianas tienen la capacidad
de formar biofilms, algunos géneros lo forman más fácil y rápidamente que
otros, como es el caso de Pseudomonas, Listeria, Staphylococcus y Bacillus
reportado por Mattila-Sandholm y Wirtanen (1992); Lee Wong (1998).
En un ambiente de procesado de alimentos, la microbiota existente
probablemente esté formada por una mezcla de muchas especies según
Bagge-Ravn y otros (2003). Sin embargo, no se ha podido demostrar hasta
la fecha si la presencia de unas especies u otras es fruto de un fenómeno de
selección natural.
Según González (2005), si bien son numerosas las especies susceptibles de
formar biofilms en la industria de producción de alimentos se citan a
continuación algunas de especial importancia en relación con la seguridad
alimentaria.
2.9.1 Salmonella spp
Al igual que el resto de las enterobacterias, este género está formado por
bacilos cortos Gram negativos, no esporulados, anaerobios facultativos y
móviles en su mayoría. Estas bacterias se encuentran ampliamente
distribuidas por la naturaleza, son bastante resistentes a las condiciones
ambientales y muy poco exigentes en sus requisitos nutricionales lo que les
permite un rápido crecimiento y capacidad de colonización de ambientes muy
diversos, entre ellos el agua y los alimentos según Todar (2008).
Según datos de la European Food Safety Authority, Salmonella spp. es el
primer causante de brotes de toxiinfección alimentaria en la Unión Europea
(UE) en los últimos años EFSA (2009).
18
Varios estudios han demostrado que Salmonella se puede adherir y formar
biofilms en superficies que se encuentran en las plantas de procesado de
alimentos y entre las que se incluyen plástico, cemento y acero según
Joseph y otros (2001); Chmielewsky y Frank (2003).
Según Lasa y otros (2009), diversos estudios han demostrado que
Salmonella, E. coli y muchas otras enterobacterias producen celulosa como
exopolisacárido principal de la matriz del biofilm y que la formación de éste
resulta esencial para la supervivencia de la bacteria en el ambiente.
2.9.2 Escherichia coli ATCC 35218
Todar (2008), reportaron que este género bacteriano está formado por
bacilos Gram negativos, catalasa positivos y oxidasa negativos, no
formadores de esporas, anaerobios facultativos con un amplio rango de
incubación, inmóviles o móviles mediante flagelos peritricos y con
necesidades nutricionales sencillas.
Para la formación de biofilms, E. coli emplea flagelos, pilis y proteínas de
membrana para iniciar la adhesión. Cuando ya está unida a la superficie
pierde sus flagelos e incrementa la producción de sustancias poliméricas
extracelulares según González (2005); Houdt y Michiels (2005).
Estudios han encontrado que algunas cepas de E. coli ATCC 35218 pueden
desarrollar
biofilms
como
resultado
de
una
mayor
producción
de
exopolisacáridos según Ryu y Beuchat (2004). Además, se ha demostrado
que la formación de biofilm proporciona una mayor resistencia a E. coli ATCC
35218 cuando se expone a soluciones de hipoclorito, uno de los
desinfectantes de mayor uso en la industria alimentaria según Ryu y Beuchat
(2005).
19
2.9.3 Staphylococcus aureus ATCC 25923
Las bacterias del género Staphylococcus son microorganismos ubicuos
difíciles de eliminar que colonizan ambientes muy dispares formando parte
de la microbiota habitual de la piel, la garganta y las fosas nasales de sus
hospedadores vertebrados.
Staphylococcus aureus es un coco Gram positivo aerobio o anaerobio
facultativo que produce fermentación láctica y es catalasa y coagulasa
positivo.
Posee
numerosos factores
de
virulencia,
en
su
mayoría
componentes de la pared celular, y una variedad de exoproteínas que
facilitan la colonización de nuevos hábitats. Estas propiedades, hacen que
los estafilococos sean la causa de numerosas infecciones en mamíferos, que
van desde afecciones superficiales de la piel a patologías severas como
neumonías,
meningitis,
intoxicaciones
alimentarias,
shock
séptico
y
desórdenes autoinmunes Todar (2008).
Es un importante patógeno alimentario, y la intoxicación estafilocócica es una
de las causas más prevalentes de gastroenteritis en el mundo. Según datos
de la EFSA, S. aureus fue el causante del 4,1 % de los brotes de infecciones
alimentarias acaecidos en 2006 en la UE según EFSA (2007).
Esta bacteria se puede encontrar en alimentos crudos, equipos o
manipuladores y puede pasar a otros alimentos por contaminación cruzada,
si bien necesita multiplicarse hasta alcanzar concentraciones de 105 ufc/g
para producir la toxina y provocar la enfermedad. Los tiempos de
supervivencia de Staphylococcus aureus se ven incrementados con bajas
temperaturas, altos pH según González (2005).
20
2.10 Importancia de los biofilms en la industria alimentaria
Por esto hoy en día la industria alimentaria ha tratado con gran énfasis en
corregir este tipo de problemas generando programas eficientes de limpieza
y desinfección, que de no ser aplicados generan un fuerte impacto
económico sobre la industria y además pueden traducirse en un serio
problema de sanidad para los consumidores.
Sin embargo, su presencia puede ser perjudicial e indeseable puesto que en
muchos casos producen contaminaciones del producto acabado. Lo que se
traduce en una disminución del periodo de conservación o incluso en una
transmisión potencial de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA).
Gracias a la globalización en el comercio de alimentos, hoy en día lo que se
produce en un país se vende y consume en todo el mundo. Esto significa que
un producto alimentario contaminado puede causar brotes de enfermedad en
muchos países al mismo tiempo, involucrando a cientos, e incluso miles de
personas. La vigilancia por tanto, debe tener una sensibilidad tal que permita
tomar medidas oportunas para el control de brotes, y que también permita su
prevención, constituyéndose en un componente esencial de cualquier
sistema de inocuidad alimentaria.
Desde un punto de vista tecnológico, hoy día se sabe que los biofilms
pueden ocasionar reducción de la transmisión del calor, pérdidas
energéticas, bloqueo de los poros de membranas y la corrosión de metales.
En resumidas cuentas, todo ello se traduce en pérdidas económicas para las
industrias.
21
III.
MATERIALES Y METODOS.
3.1 Lugar de ejecución
Laboratorio de Microbiología y Biotecnología del Departamento de Ciencia de
la Universidad Privada Antenor Orrego.
3.1.1 Materiales y equipo
Materiales
Material biológico
Salmonella spp, Escherichia coli ATCC 35218 y Staphylococcus
aureus ATCC 25923.
Reactivos
Agua destilada
Cristal Violeta
Alcohol
Instrumentos
Gradilla
Asa bacteriológica en asa y punta
Placa Petri
Pinza
Mechero
Micropipeta 10 – 100 uL Marca Brand
Puntas de micropipetas estériles
Espátula o asa drigalski
Pipeta de 10 mL ± 0.1
22
Pipeta de 5 mL ± 0.1
Piseta
Tubos de ensayo pyrex
Tubos de ensayo pyrex con tapa rosca
Frasco con tapa rosca de 100 mL Marca Boeco
Matraz de 1000 mL
Probeta de 1000 mL
Medios de cultivo nutritivo
Agar MacConkey
Agar Manitol Salado
Medio Luria Bertani (LB)
Agar Tres Azucares y Hierro (TSI)
Agar Triptona Soya (TSA)
Envases
Polietileno tereftalato (PET)
Polietileno de baja densidad (PEBD)
Equipos
Cámara de radiación ultravioleta (UV)
Balanza. Marca Lantescale. Estándar Features
Espectrofotómetro. Marca Genesys 6
Autoclave. All American. Rango 100 – 133 oC. 15 lb.
Horno. Marca Thomas Elektrogeräte. Rango 100 – 250 oC
Hornilla eléctrica. Marca USA Ilumi. Rango min. 1 - max. 9
Incubadora. Marca Memmert. Made in west Germany. Rango 0 - 70 oC
23
Refrigeradora. Marca Bosch Extra Cool +2 +4 +6 +8 +10 oC
Congeladora. Marca Bosch -24 -18 oC
3.2 Metodología
3.2.1 El esquema experimental
El esquema experimental para la formación de biofilms bajo condiciones in
vitro, tiene como variables independientes las bacterias Salmonella spp,
Escherichia coli ATCC 35218 y Staphylococcus aureus ATCC 25923, los
envases (Polietileno tereftalato y polietileno de baja densidad) y los tiempos
de incubación (6, 12, 24 y 48 horas), y como variable dependiente la
formación de biofilms como se aprecia en la figura 1.
24
Viales criogénicos
M1
M3
M2
E1
E2
E1
E1
E2
E2
37 ºC
T1
T2
T3
T4
T1
T2
T3
T4
T1
T2
T3
T4
T1
T2
T3
T4
Formación de biofilms bajo condiciones in vitro
M1: Salmonella spp.
T1: Tiempo de incubación a 6 h
M2: Escherichia coli ATCC 35218.
T2: Tiempo de incubación a 12 h
M3: Staphylococcus aureus ATCC 25923.
T3: Tiempo de incubación a 24 h
E1: Polietileno tereftalato (PET).
T4: Tiempo de incubación a 48 h
T1
T2
T3
T4
Densidad óptica
E2: Polietileno de baja densidad (PEBD).
Figura 1. Esquema experimental para la formación de biofilms bajo condiciones in vitro.
T1
T2
T3
T4
25
3.2.2 Método experimental
3.2.2.1 Proceso de formación de biofilms bajo condiciones in vitro.
En la figura 2, se muestra el diagrama de flujo para el proceso de formación
de biofilms bajo condiciones in vitro.
VIAL CRIOGÉNICO
REFRIGERACION
ACONDICIONAMIENTO 1
INCUBACION 1
INOCULACION 1
INCUBACION 2
ACONDICIONAMIENTO 2
IE
INCUBACION 3
INOCULACION 2
INCUBACION 4
FORMACIÓN DE BIOFILMS
Figura 2. Diagrama de flujo para el proceso de formación de
biofilms bajo condiciones in vitro.
26
Descripción de cada operación:
A continuación se detalla la descripción para el proceso de formación de
biofilms bajo condiciones in vitro.
Refrigeración. Las diferentes cepas microbianas de Salmonella spp,
Escherichia coli ATCC 35218 y Staphylococcus aureus ATCC 25923 fueron
obtenidas de los viales criogénicos que están a -24 °C, que luego pasaron a
refrigeración a 4 °C por 6 h.
Acondicionamiento 1. Luego de la refrigeración las cepas microbianas
pasaron a temperatura ambiente a 25 °C, se realizaron estriados de las
cepas sobre las placas (siembra) con medio de cultivo de acuerdo al tipo de
microorganismo.
Incubación 1. Las placas sembradas se incubaron a 37 ºC x 24 h.
Inoculación 1. De las placas sembradas se realizó una azada en 20 mL en
caldo Luria Bertani para cada tratamiento.
Incubación 2. Luego de la inoculación se incubó de noche (overnight) a 37
ºC x 16 h.
Acondicionamiento 2. Se realizó una resiembra, se tomó 4 mL de la
incubación de noche en 16 mL de caldo Luria Bertani fresco.
Incubación 3. La resiembra se incubó a 37 ºC por 1 h.
27
Inoculación 2. A cada tubo de ensayo que contenía 4 mL de caldo Luria
Bertani fresco y el tipo de envase, se procedió a inocular con 10 µL de la
resiembra.
Incubación 4. Después de inocular cada tratamiento, se incubó a diferentes
tiempos 6, 12, 24 y 48 h.
3.3 Metodología de análisis
3.1 Cuantificación de la formación de biofilms bajo condiciones in vitro
La cuantificación de la formación de biofilms bajo condiciones in vitro, se
realizó según el método descrito por O`Toole y Kolter (1998) con algunas
modificaciones. Este método se realizó en tubos de ensayo que contuvieron
4 mL de caldo Luria Bertani fresco y un tipo de envase (3 cm x 1 cm), luego
se inoculo 10 µL de cada bacteria para cada tratamiento, como control
negativo se tuvo un tubo de ensayo que solo contenía caldo Luria Bertani
fresco y el tipo de envase sin inoculo y como control positivo la formación de
biofilm. Luego de transcurrido cada período de incubación se procedió a
eliminar el contenido de caldo Luria Bertani de los tubos de ensayo y se
realizó dos lavados con agua destilada estéril, los tubos de ensayo que
contienen el tipo de envase (PET o PEBD) para la formación de biofilms se
dejaron secar a temperatura ambiente, seguidamente se agregaron 4 mL de
cristal violeta al 0.01 % (Deighton y otros, 2001) por 2 minutos, luego se
vertió el contenido de cristal violeta y se realizó un nuevo lavado con agua
destilada estéril. Finalmente se adiciono 4 mL de alcohol y pasado 5 minutos
se cuantificó su densidad óptica en el espectrofotómetro a 620nm. Para
medir la formación
de biofilms
(FM) (Kadurugamuwa
se utilizó la siguiente
fórmula:
FB = DOa620nm
– DOb620nm
y otros,
2003)
DOa620nm es la densidad óptica a 620 nm de las bacterias adheridas y
DOb620nm es la densidad óptica a 620 nm del control negativo (no inoculado)
28
3.2 Método estadístico.
Para esta investigación se consideró un diseño de bloque completo al azar
con arreglo trifactorial de 3 bacterias x 2 envases x 4 tiempo de incubación x
5 repeticiones. A los datos obtenidos se aplicó una prueba de Levene
modificada para determinar homogeneidad de varianzas, seguido de un
análisis de varianza (ANOVA) con un nivel de significación de 0.05 para
determinar diferencias significativas y finalmente se aplicó una prueba de
Duncan para determinar tendencias hacia el tratamiento que brinde la mejor
formación e biofilms.
Los análisis estadísticos se realizaron usando el software estadístico SPSS
(Statistical Package for the Social Sciences) versión 20. El nivel de confianza
usado fue de 95 %.
29
IV.
RESULTADOS Y DISCUSION
4.1 Formación de biofilms bajo condiciones in vitro.
En la figura 3, se muestra la formación de biofilms bajo condiciones in vitro,
donde se observa una tendencia creciente a medida que pasan las horas de
incubación, induciendo la mayor formación de biofilms bajo condiciones in
vitro M1E1 (Salmonella spp. y el envase de polietileno tereftalato) y M2E1
(Escherichia coli ATCC 35218 y el envase de polietileno tereftalato), mientras
que M3E2 (Staphylococcus aureus ATCC 25923 y el envase polietileno de
Densidad óptica (620 nm)
baja densidad) presentó menor formación de biofilms.
T
Tiempo
(horas)
Tiempo (horas)
Figura 3. Formación de biofilms bajo condiciones in vitro.
Dónde:
M1: Salmonella spp.
E1: Polietileno (PET)
M2: Escherichia coli ATCC 35218
E2: Polietileno de baja densidad (PEBD)
M3: Staphylococcus aureus ATCC 25923
30
En la mayoría de los estudios, la formación de biofilms por diferentes
especies de microorganismos es estimada por densidad óptica, luego las
bacterias adheridas al vidrio, plástico u otro material son teñidas con cristal
violeta (CV) u otros colorantes que indican la biomasa total. El CV es un
colorante
básico
que
se
une
a
moléculas
superficiales
cargadas
negativamente y a polisacáridos en la matriz celular (Peeters y otros 2008)
Al-Shuneigat y otros (2005), determinaron la formación de biofilms mediante
un ensayo en microplacas de poliestireno (90 pozos), utilizando coliformes
totales y coliformes termotolerantes incubadas a 35 ºC y 44,5 ºC
respectivamente por 18 h. Para cuantificar la densidad óptica como una
estimación de la capacidad de formación de biofilms, la medición se realizó a
490nm. Un porcentaje significativo en ambos grupos, demostró la capacidad
de formación de biofilms, los coliformes totales el 50,0 %, y los coliformes
termotolerantes un 65,5 % formaron biofilms.
Danese y otros (2000), evaluaron la formación de biofilms por cuatro cepas
(E. coli 1, E.coli 2, E. coli 3 y E. coli ATCC), el estudio se realizó en cuatro
caldos de cultivo distintos M63 (US Biological, Swampscott, EEUU), M9
(Sigma), LB (Luria Bertani) y MH-II (Mueller-Hinton II) respectivamente, se
incubaron a 30 ºC durante 24 h. Utilizaron pocillos con los distintos caldos no
inoculados como controles negativos. Los biofilms adheridos en los pocillos
de poliestireno fueron teñidos con 130 µL de cristal violeta al 1 % durante 5
minutos, luego los pocillos lavados 4 veces con 150 µL de agua destilada, y
se obtuvieron la densidad óptica (630 nm) del crecimiento de la formación de
biofilms en lector de placas.
31
Hernández y otros (2009), investigaron la formación de biofilms, utilizaron en
su estudio 15 cepas de Salmonella. Emplearon dos placas de poliestireno
con 24 pozos cada una, las placas inoculadas se incubaron a 37 ºC por 24,
48 y 72 horas. Los valores de densidad óptica registrados en cada ensayo se
promediaron y se clasificaron en las categorías de: productora de biofilms
moderada o biofilms fuerte.
4.2 Efecto del tipo envase y tiempo de incubación sobre la formación de
biofilms bajo condiciones in vitro.
En el Cuadro 4, se presentó la prueba de Levenne modificada con los datos
transformados (raíz cuadrada), donde se observó homogeneidad de varianza
(p>0.05), por lo que se procedió a realizar un análisis de varianza y
posteriormente la prueba de Duncan.
Cuadro 4. Prueba de Levenne modificada con los datos transformados
(raíz cuadrada) para la formación de biofilms bajo condiciones in vitro.
Estadístico de
Grados de
Grados de
Levenne
Libertad 1
Libertad 2
1.000
23
96
p
0.476
32
En el Cuadro 5, se presentó el análisis de varianza, donde se observó efecto
significativo para cada bacteria, tipo de envase y tiempo de incubación sobre
la formación de biofilms bajo condiciones in vitro a un nivel de confianza del
95 %.
Cuadro 5. Análisis de varianza para formación de biofilms bajo
condiciones in vitro.
Variable
Fuente de
variación
Bacteria: A
Envase: B
Tiempo: C
Formación A*B
A*C
de
biofilms B*C
A*B*C
Error
Total
Suma de
cuadrados
Grados de
libertad
Cuadrados
medios
1.033
1.285
0.681
0.496
0.593
0.246
0.811
0.245
5.389
2.000
1.000
3.000
2.000
6.000
3.000
6.000
96.000
119.000
0.517
1.285
0.227
0.248
0.099
0.082
0.135
0.003
F
p
202.651
503.925
89.051
97.218
38.728
32.138
52.987
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
Resultado similar fue reportado por Martínez (2010), quien estudió la
formación de biofilms en placas de polietileno, se evaluó el tiempo de
incubación, la proporción de inóculo, con el fin de validar las diferencias entre
estos parámetros y determinar la combinación de variables que favorecen la
formación de biofilm. Realizó un análisis de varianza que justifica que los
tratamientos tienen una influencia significativa en la formación de biofilm, con
un error p < 0.05 y un nivel de significancia del 95 %.
33
En el Cuadro 6, se muestran los resultados de la prueba de Duncan para la
formación de biofilms bajo condiciones in vitro, donde se observó que los
tratamientos M1E1 (Salmonella spp y envase de polietileno tereftalato) en el
subconjunto 8 y M2E1 (Escherichia coli ATCC 35218 y envase de polietileno
tereftalato) en el subconjunto 7, presentaron mayor formación de biofilms
bajo condiciones in vitro a las 24 horas.
34
Cuadro 6. Prueba de Duncan para la formación de biofilms bajo
condiciones in vitro.
Variables
Subconjunto
Bacteria
Envase
Tiempo
(horas)
1
2
3
4
5
6
7
M3
E2
12
0.134
M3
E1
6
0.150
M3
E2
6
0.193
0.193
M2
E2
6
0.195
0.195
0.195
M3
E2
24
0.198
0.198
0.198
M1
E2
12
0.229
0.229
0.229
M1
E2
6
0.231
0.231
0.231
M3
E1
12
0.239
0.239
0.239
0.239
M3
E2
48
0.242
0.242
0.242
0.242
M1
E2
24
0.248
0.248
0.248
0.248
M3
E1
24
0.248
0.248
0.248
0.248
M2
E2
12
0.250
0.250
0.250
0.250
M3
E1
48
0.253
0.253
0.253
0.253
M2
E2
24
0.261
0.261
0.261
0.261
M1
E2
48
0.267
0.267
0.267
M1
E1
6
0.279
0.279
0.279
M1
E1
12
0.282
0.282
0.282
M2
E2
48
M2
E1
48
0.518
M2
E1
6
0.543
M2
E1
12
0.549
M2
E1
24
0.574
M1
E1
24
M1
E1
48
8
9
0.150
0.518
0.979
1.723
Dónde:
M1: Salmonella spp.
E1: Polietileno (PET)
M2: Escherichia coli ATCC 35218
E2: Polietileno de baja densidad (PEBD)
M3: Staphylococcus aureus ATCC 25923
35
Para cuantificar mejor los tratamientos con respecto a la formación de
biofilms, se podría explicar teniendo en cuenta la mayor concentración de
bacterias; pero si bien hay una mayor concentración de bacterias, no
necesariamente se dará una mayor formación de biofilm, esto se debe a
todos los factores que pueden influir en su mecanismo de formación, desde
la adhesión hasta la maduración del mismo (Donlan y otros, 2000).
Las propiedades fisicoquímicas de la superficie también pueden ejercer una
fuerte influencia en el grado de adhesión y formación de biofilms, se ha
encontrado que la variación en la concentración de diversos cationes (sodio,
calcio, hierro) afecta la adhesión de algunas bacterias Characklis (1981). Las
características de la superficie celular como los flagelos, pili, proteínas de
adhesión y cápsulas ejercen también su influencia en la formación de
biofilms. Los flagelos, que proporcionan movimiento; los pilis, son más cortos
que los flagelos pero actúan como un sistema de cierre que permite su unión
y desunión con facilidad para fijarse a las superficies y también actúan como
quimiorreceptores dirigiendo a la bacteria hacia a algunos sitios específicos;
y las capsulas que sirven de adhesión permitiendo la colonización de
bacterias. La pérdida de estos apéndices cambia las propiedades de
superficie de la bacteria, lo que puede provocar una menor capacidad de
adhesión y en consecuencia menor desarrollo de formación de biofilms.
González (2005).
Sin embargo, los resultados mostraron que, quienes registraron una mayor
formación de biofilms sobre el tipo de envase de polietileno tereftalato fueron
las bacterias Salmonella spp. con una densidad óptica igual 0.979 y la
Escherichia coli ATCC 35218 con una densidad óptica igual 0.574 a las 24
horas de incubación.
36
V.
CONCLUSIONES
El efecto del tipo de envase y tiempo de incubación fue significativo sobre la
formación de biofilms bajo condiciones in vitro de bacterias de interés
alimentario.
Se determinó que el tiempo de incubación de 24 horas y el tipo de envase
de polietileno de tereftalato permitió la mayor formación de biofilms bajo
condiciones in vitro con la bacteria Salmonella spp.
37
VI.
RECOMENDACIONES
Es necesario en trabajos futuros, estudiar otras bacterias que puedan
favorecer la formación de biofilms, de manera que se puedan desarrollar
metodologías que permitan reducir y/o eliminar la formación de las mismas
en las plantas de procesamiento de alimentos y así asegurar productos
inocuos y de buena calidad microbiológica.
Realizar ensayos sustituyendo el plástico por el vidrio para observar que
efecto tienen las bacterias sobre la formación de biofilms.
Se recomienda que todos los tipos de materiales para envasar alimentos o
bebidas,
deban
ser
almacenados
adecuadamente
para
evitar
su
contaminación o que sufran modificaciones que posteriormente puedan
favorecer el crecimiento de los microrganismo.
Según los resultados obtenidos en esta investigación, es recomendable para
cualquier tipo alimento envasar en polietileno tereftalato teniendo en cuenta
las condiciones higiénicas adecuadas, ya que dicho envase mencionado
inducen con mayor facilidad a la formación de biofilms.
38
VII.
BIBLIOGRAFÍA
Acoplasticos. Directorio Colombiano de Reciclaje de Residuos Plásticos.
Bogotá, 2002.
Al-Shuneigat J., Cox S. & Markham J. (2005). Effects of a topical essential
oil-containing
formulation
on
biofilm-forming
coagulase-negative
staphylococci. Lett. Appl. Microbiol. 41: 52-55.
Asociación de Fabricantes de Productos Farmacéuticos (afidro), “Manual
para el control de calidad de materiales de empaque en la industria
farmacéutica en Colombia”, afidro, Bogota, 1986, pp. 400-444. Tecnología en
Comunicación Visual II. Ciclo lectivo 2006. www.tecno2dcv.com.ar
Branda, S.S., Vik, S., Friedman, L. y Kolter, R. 2005. Biofilms: the matrix
revisited. Trends in Microbiology, 13, pp: 20-26.Carpentier, B. y Cerf, O.
1993.
Characklis, W. G. (1981) Bioengineering report: Fouling biofilm development:
A process analysis, Biotechnology and Bioengineering 23, 1923-1960
Chaves C. Arias ML. Caracterización de cepas de Listeria monocytogenes
realizados a partir de queso fresco proveniente de diferentes zonas
productoras costarricenses..Arch. Lat. Nut. 2009 59 (1): 66-70.
Chaves L., Simoes M. y Joao M. 2007. Biofilm interactions between distinct
bacterial genera isolated from drinking water. Appl. Environ. Microbiol
73:6192-6200.
Chmielewsky R.A.N., Frank J.F. 2003. Biofilm formation and control in food
processing facilities. Comprehensive Reviews in Food Science and Food
Safety, 2, pp: 22 32.
39
Chole RA, Faddis BT. 2003. Anatomical evidence of microbial biofilms in
tonsillar tissues: A possible mechanism to explain chronicity. Arch
Otolaryngol Head Neck Surg, 129: 634-6.
Christensen G, Simpson A, Younker J, Baddour L, Barret F, Melton D,
Beachey E. Adherence of coagulase negative staphylococci to plastic tissue
culture plates a quantitative model for the adherence of staphylococci to
medical devices. Journal of clinical Microbiology 1985; 22: 996-1006.
Costerton, J.W. 1995. Overview of microbial biofilms. Journal of Industrial
Microbiology, 15, pp: 137-140.
Costerton JW. Introduction to biofilms. Int J Antimicrob Agents 1999; 11: 217
221.
Danese PN, Pratt LA, Dove SL, Kolter R. The outer membrane protein,
antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms.
Mol Microbiol 2000, 37:424-432.
Davey, M.E. y O’Toole, G.O. 2000. Microbial biofilms: from ecology to
molecular genetics. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64 (4), pp:
847-867.
Deighton MA, Capstick J, Domalewski E, Van Nguyen Trung. Methods for
Studying Biofilms Produced by Staphylococcus epidermidis. In: Doyle RJ,
editor. Methods in enzymology. Vol 336. San Diego (California): Academic
Press. 2001; p177-95.
Donlan, R.M. 2002. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious
Diseases, 8 (9), pp: 881-890.
40
Donlan, R.M. y Costerton, J.W. 2002. Biofilms: survival mechanisms of
clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews, 15 (2), pp:
167-193.
EFSA. 2007. European Food Safety Authority. The Community Summary
Report on Trends and Sources of Zoonoses and Zoonotic Agents in the
European Union in 2006.
EFSA. 2009. The Community Summary Report on Trends and Sources of
Zoonoses and Zoonotic Agents in the European Union in 2007.
Else, T.A., Pantle, C.R. y Amy, P.S. 2003. Boundaries for Biofilm Formation:
Humidity and Temperature. Applied and Environmental Microbiology, 69, pp:
5006-5010.
Ficha de datos de seguridad. Actualización de FDS/P 10092/30/01/2004, url:
http://www.solvayindupa.com/static/wma/pdf/PVC, consultado en octubre de
2008.
Fuster y Valls, N. 2006. Importancia del control higiénico de las superficies
alimentarias mediante técnicas rápidas y
minimizar
las
contaminaciones
tradicionales para evitar y/o
cruzadas.
Disponible
en:
http://www.tesisenred.net/TESIS_UAB/AVAILABLE/TDX1005107165210//nfv
1de1.pdf [acceso: 10-11-2009].
González, F.R. 2005. Desarrollo y aplicación de sensores para evaluar la
contaminación microbiológica de superficies domésticas españolas y de la
efectividad de desinfectantes in situ de productos limpiadores comerciales.
Disponible
en
http://www.tdr.cesca.es/TESIS_UAB/AVAILABLE/TDX-
0119106-165553//fgr1de1.pdf [acceso: 13-10-2009].
41
Hernández A. M., P. Landa S., G. Mora A., C. A. Eslava C., J. E. Call, A. C.
S. Porto Fett, and J. B. Luchansky. 2009. Characterization of Salmonella spp.
From nopal leaves and associated soil and water samples in Morelos,
Mexico. Abstracts of the Annual Meeting of the International Association for
Food Protection (37): 74-75
Houdt, R.V. y Michiels, C.W. 2005. Role of bacterial cell surface structures in
Escherichia coli biofilm formation. Research in Microbiology, 156, pp: 626633.
Jaramillo Luz Marina PhD. Profesora Titular. Facultad de Ciencias –
Departamento de Química. Santiago de Cali, 2001. Disponible en:
http://objetos.univalle.edu.co/files/Clasificacion_y_nomenclatura_de_los_com
puestos_organicos.pdf
Joseph, B., Otta, S.K. y Karunasagar, I. 2001. Biofilm formation by
Salmonella spp. on food contact surfaces andtheir sensitivity to sanitizers.
International Journal of Food Microbiology, 64, pp: 367-372.
Kadurugamuwa JL, Sin L, Albert E, Yu J, Francis K, DeBoer M, Rubin M,
Bellinger-Kawahara C, Parr Jr TR, Contag PR. Direct continuous method for
monitoring biofilm infection in a mouse model. Infect Immun 2003, 71:882890.
Keskinen, L.A., Todd, E.C.D. y Ryser, E. 2008. Transfer of Surface-Dried
Listeria monocytogenes from Stainless Steel Knife Blades to Roast Turkey
Breast. Journal of Food Protection, 71, pp: 176-181.
Kraigsley, A., Ronney, P.D. y Finkel, S.E. 2002. Dynamics of self-propagating
fronts
Disponible
en:
http://carambola.usc.edu/research/biophysics/BacterialFronts.html
[acceso:
10-11-2009].
of
motile
bacteria.
42
Kumar, C.G. y Anand, S.K. 1998. Significance of microbial biofilms in food
industry: a review. International Journalof Food Microbiology, 42, pp: 9-27.
Lasa, I., del Pozo, J.L. y Penadés, J.R. 2009. Biofilms Bacterianos e
infección.http://www.cfnavarra.es/salud/anales/textos/vol28/n2/colaba.html
[acceso: 13-10-2009].
Lee Wong, A.C. 1998. Biofilms in Food Processing. Enviroments. Journal of
Dairy Science, 81, pp: 2765-2770.
Lewis, K. 2001. Riddle of biofilms resistance. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy. 45 (4): 999-1007.
Marriott N. 1999 Principios de Higiene Alimentaria. Acribia S.A. 4ª Edición,
España. Oxford University Press España. S.A. 2011. Disponible en:
www.oupe.es/es/Secundaria/Tecnologias/.../35_5_1_REF_AMPL.pdf
Mattila-Sandholm, T. y Wirtanen, G. 1992. Biofilm formation in the industry: A
review. FoodReviews International, 8 (4), pp: 573-603. H
Yenny R., Martínez Díaz. 2010. “Evaluación de un bioensayo para medir la
inhibición de biopelículas bacterianas como indicativo de la actividad
antifouling de compuestos de origen natural”.
Niu C, Gilbert ES. Colorimetric method for identifying plant essential oil
components that affect biofilm formation and structure. Appl Environ Microbiol
2004, 70: 6951-6956.
Niu O`Toole G, Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary
for P.aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol. 30(2):295-304, 1998. C,
Gilbert.
Pedersen, Suecia 1990, en http://www.adiveter.com/ftp/articles/A1070308.pdf
43
Peeters E, Nelis HJ, Coenye T. Comparisons of multiple methods
forquantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J Microbial
Methods 2008, 72: 157-165.
Pérez-Rodríguez, F., Valero, A., Carrasco, E., García, R.M. y Zurera, G.
2008. Understanding and modelling bacterial transfer to foods: a review.
Trends in Food Science & Technology, 19, pp: 131-144.
Ramadan HH, Sanclement JA, Thomas JG. Chronic
rhino sinusitis and
biofilms. Otolaryngol Head Neck Surg. 2005; 132:414-7.
Ravishankar, S. y Juneja, V.K. 2003. Adaptation or Resistence responses of
Microorganisms to Stresses in the Food Processing Environment. En
Microbial Stress Adaptation and Food Safety, ed. Yousef y Juneja.CRC.
Press LL.C. London. Pp. 105-158.
Ryu, J. H.y Beuchat, L.R. 2004. Attachment and biofilm formation by
Escherichia
coli
O157:H7
on
stain
lesssteel
as
influenced
by
exopolysaccharide production, nutrient availability, and temperature. Journal
of FoodProtection, 67, pp: 2123-2131.
Ryu, J.H. y Beuchat, L.R. 2005. Biofilm Formation by Escherichia coli
O157:H7 on Stainless Steel: Effect of Exopoly saccharideand Curli
Production on Its Resistance to Chlorine. Applied and Environmental
Microbiology, 7, pp: 247-254.
Serra, P.G. (2003). Estudio de biofilms: formación y consecuencia.
Disponible en: http://magno.uab.es/epsi/alimentaria/ biofilm.pdf [acceso: 1310-2009].
Soto SM, Smithson A, Horcajada JP, Martinez JA, Mensa JP, Vila J.
Implication of biofilm formation in the persistence of urinary tract infection
44
caused by uropathogenic Escherichia coli. Clin Microbiol Infect 2006,
12:1034-1036.
Stepanovic, S.; D. Vukovic ; I. Dakic; B. Savic y M. Svabicvlahovic: “A
Modified Microtiter-Plate Test for Quantification of Staphylococcal Biofilm
Formation”, Journal of Microbiological Methods, 40 (2000), pp. 175-179.
Stepanovic S, Cirkovic I, Raning L & Svabic-Vlalhovic M. Biofilm formation by
Salmonella spp and Listeria monocytogenes on plastic surface. Lettrs. Appl.
Microbiol. 2004. 38: 428-432.
Sutherland, I.W. 2001. Biofilms exopolysaccharides: a strong and stick
framework. Microbiology. 147:3-9.
Todar, K. (2008). Todar’s Online Textbook of Bacteriology. Disponible en:
http://www.textbookofbacteriology.net/kt_toc.html [acceso: 10-11-2009].
Trachoo, N. Biofilms and the food industry. Journal Science Technology.
2003; 25(6):807- 815p.
Wimpenny J., Manz W. & Szewzyk U. (2000). Heterogeneity in biofilm.
Microbiology reviews. 24: 661-671.
45
VIII.
ANEXOS
Anexo 1. Medidas estadísticas de la formación de biofilms.
Bacteria
Envase
E1
M1
E2
E1
M2
E2
E1
M3
E2
6
0.279
Tiempo (horas)
12
24
0.282
0.979
48
1.723
Desv. típ.
0.019
0.029
0.045
0.045
Media
0.231
0.229
0.248
0.267
Desv. típ.
0.074
0.030
0.031
0.037
Media
0.543
0.549
0.574
0.518
Desv. típ.
0.161
0.080
0.045
0.070
Media
0.195
0.250
0.261
0.315
Desv. típ.
0.043
0.050
0.053
0.050
Media
0.150
0.239
0.248
0.253
Desv. típ.
0.038
0.021
0.024
0.024
Media
0.193
0.134
0.198
0.242
Desv. típ.
0.080
0.071
0.025
0.051
Medida
estadística
Media
Dónde:
M1: Salmonella spp.
E1: Polietileno (PET)
M2: Escherichia coli ATCC 35218
E2: Polietileno de baja densidad (PEBD)
M3: Staphylococcus aureus ATCC 25923
46
Anexo 2. Desviación estándar de los valores promedios de la formación
de biofilms.
2.0
M1E1
M1E2
M2E1
M2E2
M3E1
M3E2
1.8
1.6
Densidad óptica (620 nm)
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
-0.2
6
12
24
Tiempo (horas) 48
YX
Dónde:
M1: Salmonella spp.
E1: Polietileno (PET)
M2: Escherichia coli ATCC 35218
E2: Polietileno de baja densidad (PEBD)
M3: Staphylococcus aureus ATCC 25923
47
Anexo 3. Prueba de Levenne modificada sin datos transformados para
la formación de biofilms bajo condiciones in vitro.
Estadístico de
Grados de
Grados de
Levenne
libertad 1
libertad 2
1.690
23
96
p
0.042
Anexo 4. Promedio de los resultados de la formación de biofilms por
densidad óptica (620 nm) de la bacteria Salmonella spp. sobre el envase
de polietileno tereftalato.
Tiempo (h)
12
24
Densidad óptica (DO)
6
48
DO1
0.380
0.366
1.134
1.854
DO2
0.342
0.337
1.041
1.846
DO3
0.370
0.407
1.097
1.741
DO4
0.358
0.353
1.038
1.808
DO5
Promedio de la formación de biofilms
0.391
0.3682
0.393
0.3712
1.031
1.0682
1.810
1.8118
48
Anexo 5. Promedio de los resultado de la formación de biofilms por
densidad (620 nm) de la bacteria Escherichia coli ATCC 35218 sobre el
envase de polietileno tereftalato.
Tiempo (h)
12
24
Densidad óptica (DO)
6
48
DO1
0.780
0.636
0.643
0.547
DO2
0.783
0.625
0.709
0.655
DO3
0.632
0.756
0.617
0.514
DO4
0.442
0.535
0.611
0.598
DO5
Promedio de la formación de biofilms
0.481
0.6236
0.600
0.6304
0.694
0.6548
0.681
0.599
Anexo 6. Promedio de los resultados de la formación de biofilms por
densidad óptica (620 nm) de la bacteria Staphylococcus aureus ATCC
25923 sobre el envase de polietileno tereftalato.
Tiempo (h)
12
24
Densidad óptica (DO)
6
48
DO1
0.313
0.325
0.330
0.334
DO2
0.212
0.356
0.370
0.383
DO3
0.244
0.335
0.340
0.362
DO4
0.246
0.335
0.348
0.337
DO5
0.271
Promedio de la formación de biofilms 0.2572
0.378
0.3458
0.388
0.3552
0.384
0.3600
49
Anexo 7. Promedio de los resultados de la formación de biofilms por
densidad óptica (620 nm) de la bacteria Salmonella spp. sobre el envase
de polietileno de baja densidad.
Tiempo (h)
12
24
Densidad óptica (DO)
6
48
DO1
0.335
0.234
0.229
0.260
DO2
0.212
0.209
0.309
0.352
DO3
0.335
0.283
0.274
0.278
DO4
0.181
0.268
0.257
0.269
DO5
Promedio de la formación de biofilms
0.213
0.2552
0.270
0.2528
0.292
0.2722
0.295
0.2908
Anexo 8. Promedio de los resultados de la formación de biofilms por
densidad óptica (620 nm) de la bacteria Escherichia coli ATCC 35218
sobre el envase de polietileno de baja densidad.
Tiempo (h)
12
24
Densidad óptica (DO)
6
48
DO1
0.243
0.313
0.208
0.393
DO2
0.199
0.215
0.341
0.396
DO3
0.298
0.341
0.298
0.272
DO4
0.191
0.257
0.3
0.344
DO5
Promedio de la formación de biofilms
0.223
0.2308
0.306
0.2864
0.336
0.2966
0.349
0.3508
50
Anexo 9. Promedio de los resultados de la formación de biofilms por
densidad óptica (620 nm) de la bacteria Staphylococcus aureus ATCC
25923 sobre el envase de polietileno de baja densidad
Tiempo (h)
12
24
Densidad óptica (DO)
6
48
DO1
0.200
0.137
0.272
0.218
DO2
0.206
0.158
0.214
0.239
DO3
0.376
0.3
0.256
0.335
DO4
0.198
0.135
0.228
0.31
DO5
0.184 0.138
Promedio de la formación de biofilms 0.2328 0.1736
0.219
0.2378
0.31
0.2824