Control de Nichos S.aureus

Factores de adhesión y nichos de persistencia
de
Staphylococcus aureus
Dr.. Pablo
b o Hernández
e
de JJáuregui
u egu y Álvarez
v e
CyTA Labs
Micrografía electrónica de transmisión de S aureus que
muestra la adhesión entre las bacterias (a y d), fenómeno
requerido para la multiplicación bacteriana (b y c).
Factores de adhesión y nichos de persistencia de
Staphylococcus aureus
Exposición y contactos con individuos colonizados en
forma extensa;; nariz,, glándula
g
mamaria,, piel
p pezones.
p
Ambiente de Hospital, centros de concurrencia en el
hombre
Sala de ordeño, equipo y/o ordeñadores
Factores de adhesión y nichos de persistencia de
Staphylococcus aureus
Mecanismo
Huésped
p
S aureus
General
Edad, sexo
virulencia
Clase Socio económica
uso de antibióticos
Padecimientos existentes
(insulina-dependencia
diabetes mellitus, HIV,
enfermedad
f
d d hepática,
h áti
eczema,
antibiótico
resistencia
anormalidades nasales, y otras
tipo de HLA, estado inmune
Lancet Infect Dis 2005; 5: 751–62
Mecanismo
Evasión respuesta inmune
Huésped
S aureus
Mucosa/ barrera piel
Proteasas,
lipasas
Eliminación por moco
microvellosidades
i
ll id d
Huésped célula
internalización
Inmunoglobulina
Proteína A
(adherencia Fc de
IgG)
Lysozyma, lactoferrina, Resistencia a
péptido
antimicrobiano
Opsonización
Cápsula
Lancet Infect Dis 2005; 5: 751–62
Mecanismo
Adherencia
S aureus
Huésped
Receptores
Adhesinas
Proteínas Extra celulares
de matriz
MSCRAMMs
Citoqueratina tipo 10
Clumping factor B
Membrana epitelial
(Lipo)teichoico
ácido
Cápsula
Mucinas
Capsulares
polisacáridos
Carga Superficial
Carga Superficial
Hidrofobicidad
Hidrofobicidad
Lancet Infect Dis 2005; 5: 751–62
Mecanismos de evasión de la opsonofagocitosis de S. aureus. La figura ilustra (a) la cápsula de
polisacáridos,, q
p
que dificulta el acceso de los neutrófilos a complemento
p
y anticuerpos
p acoplados
p
en la superficie de la bacteria; (b) la estafiloquinasa extracelular (Sak), que activa plasminógeno
que degrada IgG y C3b; (c) proteína A con 5 IgG acoplados por su dominio Fc; (d) proteína
acopladora de fibrinógeno (Efb) se acopla al factor de complemento C3 y bloquea su depósito
en la
l superficie
p fi i d
de lla b
bacteria.
t i L
La activación
ti ió d
dell complemento
pl
t mas allá
llá d
de lla adherencia
dh
i d
de C3b
es evitado, previniendo la opsonización. (e) Factor de aglutinamiento A (ClfA), que se acopla a
la cadena g de fibrinógeno.
S. aureus, factores de virulencia
„
Proteína A
„
Cápsula
Asociada a la pared
celular
protección de la bacteria
„
Hemolisina
lisis eritrocitos, hierro captación
„
Coagulasa
g
Coagulación
g
Celular
„
Alpha/beta
toxins
Cito--toxinas
Cito
„
Enterotoxina
Toxicidad
„
Ácido(lipo)teichoic
componente mayor pared celular
S. aureus, factores de virulencia
Fib
Fibronectina
i b
bp
Internalización Celular
C l l
Fib i ó
Fibrinógeno
b
bp
P
Puentes
a células
él l endoteliales
d li l
Colágena bp
Adhesión vía la Integrina con
adhesión a la colágena
Lipasa
Enzima extracelular, degrada
ácidos grasos
Glicocalix
Protección a la célula bacteriana
Micrografía
g
electrónica de barrido de una microcápsula
p
de latex
con S aureus adherido a la superficie, mecanismo que logra por
el Ácido Lipoteichoico.
Micrografía
g
electrónica de barrido de una microcápsula
p
de latex.
Las flechas señalan a las partículas de S aureus adheridas.
MV
Sa
A
M
B
Micrografías electrónicas de barrido de dos células del epitelio
respiratorio inoculadas con S aureus. A, célula con revestimiento de
microvellosidades (MV) sin adhesión de S aureus. B, Célula sin
revestimiento de microvellosidades y con mucina (M). Numerosas
partículas de S aureus adheridas a la superficie.
Microfotografía
Mi
f
fí de
d cuatro células
él l de
d descamación
d
ió del
d l epitelio
i li nasal,l de
d un individuo
i di id
colonizado con S aureus. Tinción para muco polisacáridos. Note que la célula del centro
es de color magenta por la identificación de los muco polisacáridos en su superficie así
como
omo numerosos
n merosos S aureus
re s adheridos.
dheridos Las
L s partículas
p rtí l s esféricas
esféri s corresponden
orresponden a S.
S aureus
re s
(flechas).
A, Célula de
A
descamación del
epitelio estratificado de
la nariz de un individuo
colonizado con S
aureus. Las partículas
en negro
g corresponden
p
a S aureus adheridos.
B, Célula de
d
descamación
ió con
mayor grados de
lisis. Numerosos
grupos de S
aureus se
advierten
adheridos a la
superficie celular.
A
B
Dos células de descamación de epitelio nasal de un individuo colonizado con S aureus.
Note que conforme el grado de queratinización y por ello exhibición de receptores, los S
aureus (partículas
( tí l esféricas
fé i negras)) son más
á numerosos en la
l célula
él l del
d l cuadrante
d t B.
B
Lancet Infect Dis 2005;
5: 751–62
Lancet Infect Dis 2005; 5: 751–62
4
2
1
3
4
6
5
Esquema que muestra la invasión intravascular de S.aureus (1), la adhesión al
Esquema que muestra la invasión intravascular de S.aureus (1), la adhesión al fibrinógeno (2), la
g
(2),
( ), la invasión al endotelio vascular (3),
( ), la estimulación de
fibrinógeno
i
invasión
ió all endotelio
d t li vascular
l (3),
(3) la
l estimulación
ti l ió de
d factores
f t
inflamatorios
i fl
t i (4) , extravasación
t
ió de
d
factores
inflamatorios
(4)
,
extravasación
de
polimorfonucleares
(5)
y
la
polimorfonucleares (5) y la liberación de S.aureus de la célula endotelial (6).
liberación de S.aureus de la célula endotelial (6).
Microfotografía al microscopio confocal de células endoteliales, con marcado
fluorescente para S aureus. Note las partículas intracitoplásmicas
fluorescentes que corresponden a S aureus dentro de las células (flechas).
Citop. Cel.
endotelial
M cel
S au
S au
V endo
Micrografía al microscopio electrónico de transmisión de una célula endotelial en cultivo,
partículas asociadas a la membrana citoplásmica
p
y las qque por
p
infectada con S aureus. Note las p
endocitosis penetraron al citoplasma y se engloban en vesículas (V endo).
B
A
A.-Micrografía
Microfotográfia
gelectrónica
electrónica
de
de transmisión
transmisión.
Células endoteliales A.
A S aureus fuera
de la célula (flecha roja) e incorporación por endocitosis al citoplasma. B. Vaso
sanguíneo con célula endotelial con ruptura de membrana citoplásmica (flechas
azules) y numerosas partículas de S aureus a punto de liberación de sus nichos
vesiculares.
Microfotografía de dos células en cultivo primario de la glándula mamaria de una vaca, con
p
de cadenas y grupos
g p de S
inoculación de S aureus. Note la adhesión a las células epiteliales
aureus (flechas).
L
L
Microfotografía
g
de sección de glándula
g
mamaria inoculada con S.aureus. Se
Observa intensa fagocitosis en células inflamatorias que ocupan el lumen (L).
Algunos staphylococcus han invadido células del epitelio acinar (flechas).
COMO CONTRO
CONTROLAR
AR LA
A CO
COLONIZACIÓN?
ON ZAC ÓN?
TERNERAS Y VACAS
DESINFECCIÓN DE NARINAS Y PEZONES A
SUSTISUCIÓN DE COLONIZACIÓN DE S AUREUS EN
NARINAS POR CEPA NO VIRULENTA
VACUNACIÓN CONTRA FACTORES DE ADHERENCIA
DE S AUREUS
Staph PM+3
Bacterina inactivada para el control de la adhesión de
Staphylococcus aureus
Construcción de un Biológico Recombinante, mediante la
clonación de fragmentos de DNA apropiados en plásmidos.
Expresiión de
E
d las
l prote
t ínas en Lactococcus
L t
lactis
l ti .
Evaluación de la correcta expresión de los antígenos en la
pared celular de L. lactis mediante técnicas de; ELISA
Inmunofluorescencia y Western blot.
Producción de L. lactis transformada:
• Proteínas recombinantes:
1
40
Sec
500 559
Región A
Adhesiión a
Adh
Fibrinógeno
ClfA
Región R
Sec
FnBPA
604
36
Región similar a
Región A (25%)
933 aa
P
M C
LPDTG
ClfA59
Adhesión a
Fib
Fibronectina
ti
1
876
Regiión D
R
878
745
1
2
3
783783- 812
4
879
1018 aa
948
Reg. WR P
FnBPA30
M C
LPETG
P: pared celular M: membrana C: citoplasma
Iniciadores en
pOri23-FnBPA
pOri For
508 bp
pOri23-ClfA
pOri23 FnBPA
pOri23-FnBPA
pOri Rev
inicio For 488bp final Rev
PCR en pOri23-FnBPA
p
L
pOri For-Rev
inicioFor-finalRev
c. neg.
Western blot:
E cl30s clo/n cl clspec clery wt
•
•
•
•
•
•
•
•
•
E:
E
cl:
fn:
cl-fn:
cl30s:
Clo/n:
clspec:
clery:
wt:
E
cl
fn cl-fn wt
escalera,
l
L. lactis cl crecimiento exponencial
L. lactis fn crecimiento exponencial
L. lactis cl-fn crecimiento exponencial
L. lactis cl crecimiento exponencial,
p
, tratamiento 30 min con lizozima.
L. lactis cl crecimiento estacionario (overnight).
L. lactis cl crecimiento exponencial, tratamiento con espectinomicina.
L. lactis cl crecimiento exponencial, tratamiento con eritromicina.
L. lactis wild type crecimiento exponencial
L. Lactis transformado con
proteínas fn-cl. Note el
reconocimiento del
antígeno en la superficie
marcado por la fluoresencia
(flechas)
L. Lactis sin transformar. La
reacción de fluorescencia
está ausente por carecer de
los antígenos
H
B
Fotografía
g
de una ratona con tres días posparto
p p
y en lactancia. Note la glándula
g
con inoculación de S.aureus de color café (flecha) en comparación con la
glándula contra lateral con la aplicación de solución salina.
Disección de las glándulas mamarias de una ratona inoculada con SS.aureus
aureus y
su control de inoculación con solución salina. Note las zonas de hemorragia y
necrosis en la glándula que recibió S.aureus (flecha).
C
G
G
Microfotografía de una glándula mamaria de ratona lactante. Los acinos glandulares
muestran las proteínas de la leche (flechas blancas) y grasa (G) y el revestimiento de
cél las epiteliales (flechas dobles).
células
dobles) En el intersticio,
intersticio capilares (C) y estroma conectivo.
conecti o
Microfografía de un acino glandular de ratona desafiada con S aureus. El incremento
en la fagocitosis (flechas) fue un fenómeno constante.
constante
L
L
Microfotografía
g
de sección de glándula
g
mamaria inoculada con S.aureus. Se
Observa intensa fagocitosis en células inflamatorias que ocupan el lumen (L).
Algunos staphylococcus han invadido células del epitelio acinar (flechas).
Grupo
Grado 1
Grado 2
Grado 3
X
X
Testigo 1
X
X
X
X
X
X
Testigo 2
X
X
Testigo 3
X
X
X
X
Inmunizada 1
X
X
Inmunizada 2
Inmunizada 3
X
X
X
X
X
Inóculo
S.aureus
S.aureus
S.aureus
Control
Control
S.aureus
S.aureus
S aureus
S.aureus
Control
Control
S.aureus
Control
S aureus
S.aureus
S.aureus
Control
S.aureus
S.aureus
Control
S.aureus
S.aureus
Control
Cuadro que muestra la celularidad inflamatoria contada en los acinos glandulares de
ratonas lactantes desafiadas con S aureus. Las ratonas 1 y 3 muestran el máximo grado
de inflamación comparadas con la inflamación moderada en las ratonas inmunizadas